PCR定量試劑盒，乃分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)里的核心工具，其選擇以及使用，會(huì)直接對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性產(chǎn)生影響。試劑盒的靈敏度，關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗，特異性程度亦關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗，操作涉及的便捷性同樣關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗，每一個(gè)環(huán)節(jié)都和這事緊密相連。下面我會(huì)依據(jù)多年積累的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，來(lái)談?wù)勗鯓舆x對(duì)PCR定量試劑盒，怎樣用對(duì)它。
如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選試劑盒
選取試劑盒時(shí)，首要之事是明晰實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。若意在基因表達(dá)分析，就得留意試劑盒的動(dòng)態(tài)范圍以及檢測(cè)下限；要是針對(duì)病毒或者細(xì)菌檢測(cè)，那就務(wù)必優(yōu)先考量靈敏度。不同品牌的試劑盒，于引物設(shè)計(jì)、熒光染料挑選方面各有偏重，像SYBR Green法適宜初篩，TaqMan探針法在多重檢測(cè)里更為具優(yōu)勢(shì)。建議去查閱同類研究的文獻(xiàn)，瞧瞧同行們采用何種試劑盒，這相較于單純查看參數(shù)更為可靠。
試劑盒靈敏度怎么判斷
衡量PCR定量試劑盒的核心指標(biāo)是靈敏度，一般以最低檢測(cè)限予以表示。然而需要留意，說(shuō)明書里的數(shù)據(jù)是于理想狀況下測(cè)得的，在實(shí)際樣本當(dāng)中有可能受到基質(zhì)的干擾。判斷靈敏度并非僅依據(jù)數(shù)字，建議借助梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品開展預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)擴(kuò)增曲線的線性關(guān)聯(lián)以及Ct值重復(fù)性予以觀察。質(zhì)量?jī)?yōu)良的試劑盒在低濃度樣本之內(nèi)仍能夠維持穩(wěn)定的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出典型的S型，并且熔解曲線具有單一性。
操作過程有哪些關(guān)鍵點(diǎn)
能否充分發(fā)揮試劑盒性能取決于操作細(xì)節(jié)。加樣環(huán)節(jié)建議采用帶濾芯的槍頭，以此避免氣溶膠污染。反應(yīng)體系配制需在冰上開展，從而保持酶活性。上機(jī)前務(wù)必要確保離心徹底，消除氣泡。尤其需要注意的是，不同試劑盒對(duì)退火溫度的要求不一樣，要嚴(yán)格依照說(shuō)明書設(shè)置程序，不要隨意進(jìn)行更改。每次實(shí)驗(yàn)都得設(shè)置無(wú)模板對(duì)照以及無(wú)反轉(zhuǎn)錄對(duì)照，這乃是排除假陽(yáng)性的關(guān)鍵所在。
結(jié)果異常怎么排查
一旦碰到擴(kuò)增曲線出現(xiàn)異常狀況，或者重復(fù)性表現(xiàn)欠佳的情形時(shí)，先別著急去更換試劑。首先要檢查一下耗材是不是相匹配，注意有的試劑盒對(duì)于PCR管的材質(zhì)有著特殊的要求；接著要確認(rèn)儀器校準(zhǔn)是不是處于有效期范圍以內(nèi)，判斷熒光信號(hào)采集通道是不是準(zhǔn)確。常見的問題像“翹尾”這種現(xiàn)象，常常是由于模板發(fā)生降解或者引物二聚體數(shù)量過多所導(dǎo)致的；而“雙峰”熔解曲線則表明有可能存在非特異性擴(kuò)增，此時(shí)需要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化或者重新去設(shè)計(jì)引物。
你于運(yùn)用PCR定量試劑盒之際碰到過哪些令人頭疼棘手的問題，而又是怎樣去解決的呢？
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