首次培養(yǎng)的細(xì)胞，是直接從機(jī)體組織分離后得到的原代細(xì)胞，其生物學(xué)特性跟體內(nèi)狀態(tài)最為相近，是基礎(chǔ)生命科學(xué)研究里不可缺少的重要工具，正確理解并掌握它的制備與培養(yǎng)技術(shù)，跟實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性以及研究結(jié)論的科學(xué)價值直接相關(guān)。
原代細(xì)胞怎么獲得
第一步是決定原代細(xì)胞質(zhì)量的組織樣本采集，動物或人體組織離體后，必須在最短時間之內(nèi)進(jìn)入處理流程，通常不超過半小時，不然細(xì)胞活性會迅速下降，采集過程中，使用含有雙抗的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗，能夠有效去除表面微生物并維持組織濕潤狀態(tài)，不同組織類型需要采用不一樣的分離方法，實(shí)體組織常用酶消化法或組織塊貼壁法，而如外周血這樣的液體樣本則通過密度梯度離心分離單個核細(xì)胞。
目前應(yīng)用最為廣泛的組織分離技術(shù)是酶消化法，富含膠原纖維的組織比如肝臟、肺臟適用膠原酶，而處理胚胎組織或者腫瘤組織胰蛋白酶則更為合適，消化的時候必須精確控制酶濃度以及消化時間，一般是在37℃水浴或者培養(yǎng)箱里持續(xù)攪拌30至60分鐘，每隔15分鐘取樣進(jìn)行觀察，當(dāng)在顯微鏡下能夠看見單細(xì)胞或者小細(xì)胞團(tuán)塊時要立刻終止消化，過度消化會嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。
原代細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵點(diǎn)
原代細(xì)胞的存活與增殖直接由培養(yǎng)體系的優(yōu)化所決定，基礎(chǔ)培養(yǎng)基要按照細(xì)胞類型選擇，像是DMEM適合成纖維細(xì)胞，RPMI - 1640對淋巴細(xì)胞生長更有利，培養(yǎng)過程中胎牛血清的質(zhì)量十分關(guān)鍵，建議通過對批次進(jìn)行篩選來找出最適宜的血清，且血清濃度通?？刂圃?0%至20%這個區(qū)間，其次原代細(xì)胞對生長因子的依賴程度較高，常常需要額外添加EGF、FGF等特定因子用以維持細(xì)胞正常分裂。
要維持原代細(xì)胞功能，培養(yǎng)環(huán)境模擬是保障，原代細(xì)胞對pH值變化很敏感，對滲透壓變化也很敏感，培養(yǎng)箱里二氧化碳濃度得精確維持在5%左右，濕度要達(dá)到飽和狀態(tài)，用來防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，換液頻率一般是每2-3天一回，不過實(shí)際操作時要依據(jù)培養(yǎng)基顏色變化以及細(xì)胞代謝狀態(tài)靈活調(diào)整，首次換液最好在細(xì)胞貼壁后24小時實(shí)施，目的是去除未貼壁的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。
原代細(xì)胞凍存怎么做
原代細(xì)胞長期保存的核心環(huán)節(jié)在于凍存液的配方選擇，二甲基亞砜為目前公認(rèn)最有效的滲透性保護(hù)劑，其使用濃度通常是5%-10% ，它可迅速滲透細(xì)胞膜以防止冰晶形成，胎牛血清作為非滲透性保護(hù)劑發(fā)揮蛋白質(zhì)保護(hù)作用，二者按9:1的比例同基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，能形成高效的細(xì)胞凍存體系，近年來無血清凍存液也漸漸普及，可減少批次差異所帶來的不確定性。
決定凍存細(xì)胞復(fù)蘇存活率的是降溫速率控制，原代細(xì)胞最理想的降溫速率是每分鐘下降1℃直至達(dá)到-80℃，這得在程序降溫儀里完成，或者采用4℃30分鐘、-20℃2小時、-80℃過夜的分步凍存方式，長期保存得轉(zhuǎn)移至液氮罐氣相中，溫度要維持在-196℃以下，復(fù)蘇時采用37℃水浴快速解凍，時間控制在1分鐘內(nèi)，解凍后馬上用預(yù)溫培養(yǎng)基緩慢稀釋去除保護(hù)劑，操作過程要輕柔防止機(jī)械損傷。
于開展原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之際，您有沒有碰到過因操作方面的細(xì)微之處致使細(xì)胞狀態(tài)不太好的情形呢，歡迎來評論區(qū)域分享您的應(yīng)對經(jīng)驗(yàn)。
