檢測試劑盒，也就是探針法PCR檢測試劑盒，是一種核酸定量檢測工具，它基于熒光探針，因具有高特異性以及靈敏度，所以在基因表達分析、轉(zhuǎn)基因檢測、環(huán)境微生物監(jiān)測等科研領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。本文會從原理、優(yōu)勢、選擇以及操作要點這幾個方面展開介紹。
探針法PCR試劑盒的工作原理
PCR采用探針法，其核心是一條能和模板特異性相結(jié)合的熒光探針，一般是TaqMan探針。探針完整時，熒光會被淬滅。在PCR延伸階段，當Taq酶碰到探針，它的5'→3'外切活性會把探針切割開，讓熒光基團和淬滅基團分離，進而發(fā)出能被儀器檢測到的熒光信號。每個循環(huán)里，熒光強度和擴增產(chǎn)物量成正比例關(guān)系，借此實現(xiàn)實時的定量檢測。這樣的機制保證了數(shù)據(jù)具備高度的可重復性。
探針法相比染料法的優(yōu)勢
有一種染料法，比如說SYBR Green這種，它能夠結(jié)合任何雙鏈DNA，然而呢，非特異性擴增或者引物二聚體同樣會產(chǎn)生信號，進而導致定量出現(xiàn)偏差。還有探針法，它要求探針與靶序列完全互補雜交才會釋放熒光，這樣特異性就顯著地提升了。另外呢，探針法支持多重檢測，就是把不同熒光標記的探針混合起來，在同一反應(yīng)管中就可以同時檢測多個靶標，能大幅節(jié)省樣本以及試劑成本。對于那些需要精確定量低豐度靶標的實驗來說，探針法是更可靠的一種選擇。
如何挑選合適的探針法PCR試劑盒
進行挑選之際，要著重留意擴增效率，以及靈敏度，還有儀器兼容性。去查看試劑盒說明書里的擴增曲線，以及標準曲線R2值，理想狀態(tài)下的擴增效率應(yīng)當處于90%至110%之間。要確認試劑盒是不是預混了熱啟動酶，以及dNTPs，還有緩沖液，預混體系能夠降低加樣誤差。與此同時，要留意ROX參比染料的配置，不同品牌的熒光定量PCR儀對于ROX的要求各異，適配錯誤會對熒光校正產(chǎn)生影響。優(yōu)先挑選提供陽性對照，以及無模板對照的完整試劑盒。
探針法PCR操作的關(guān)鍵要點
實驗臺面以及移液器之核酸酶污染于操作前要確保不存在，帶濾芯吸頭還有專用耗材予以使用。反應(yīng)體系開展配制之際，按照“酶 - 緩沖液 - 引物探針 - 模板”這般順序予以加入，氣泡產(chǎn)生要避免，加樣之后進行短暫離心實現(xiàn)混勻。無模板對照（NTC）加以設(shè)置，試劑污染進行監(jiān)控，無逆轉(zhuǎn)錄對照進行設(shè)置（僅DNA檢測可省略）。熱循環(huán)程序，引物探針的Tm值依據(jù)其來對退火溫度予以優(yōu)化，延伸時間一般設(shè)置成30秒到1分鐘。每次實驗，三個重復孔進行建議操作，數(shù)據(jù)統(tǒng)計可靠性予以確保。
