生物實驗室里極為基礎(chǔ)且極具耐心考驗性的操作是細胞培養(yǎng)，在一個培養(yǎng)瓶當中，細胞狀況的優(yōu)劣全然決定著后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的可靠程度，眾多新手于操作期間屢屢碰到污染、生長遲緩等狀況，實際上只要把控住關(guān)鍵控制點，細胞培養(yǎng)絕對能夠達至穩(wěn)定可控。
細胞培養(yǎng)如何避免污染
頭號殺手是細胞培養(yǎng)里的污染，細菌、真菌以及支原體都有可能神不知鬼不覺地潛入。操作之前得用75%酒精去擦拭超凈工作臺，紫外照射起碼要有30分鐘。所有的耗材都要歷經(jīng)高壓滅菌，培養(yǎng)基和胰酶需要進行無菌分裝。操作的時候手肘不可以越過開放瓶口，移液管一次只用一根絕對不回吸。培養(yǎng)箱的水盤要定期去添加抑菌劑，每周都要更換一下無菌水。只要把這些細節(jié)都做到位了，污染率能夠降低到5%以下。
細胞培養(yǎng)需要哪些設(shè)備
其基礎(chǔ)設(shè)備涵蓋二氧化碳培養(yǎng)箱，生物安全柜或者超凈工作臺，倒置顯微鏡。其中，培養(yǎng)箱需能夠精準控制37℃以及5% CO2，每月對溫度與氣體濃度進行一次校準。倒置顯微鏡放大倍數(shù)至少為400倍，利于觀察細胞形態(tài)以及貼壁狀況。除此之外，還需要離心機，移液器，真空泵，液氮罐。離心機用以收集懸浮細胞或者進行換液，液氮罐用于長期保存細胞株。切莫輕視冰箱，4℃存放培養(yǎng)基，-20℃存放血清，-80℃存放細胞凍存液，溫度出現(xiàn)波動均會對細胞活力產(chǎn)生影響。
細胞培養(yǎng)操作要點
細胞傳代之時，細胞融合度在達到百分之八十之際，便能夠施行消化操作，過度密集會致使接觸抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，甚至引發(fā)老化狀況。就胰酶消化而言，時間可是相當關(guān)鍵的，于三十七攝氏度的環(huán)境下，一至三分鐘，在顯微鏡下看到細胞變成圓形之時，隨即馬上終止。在施加吹打之際，力度務(wù)必要柔和，防止有氣泡產(chǎn)生，氣泡破裂所形成的值剪切力會對細胞膜造成損傷。更換培養(yǎng)液的頻率依據(jù)細胞代謝的速度來決定，一般情形下每兩天更換一回，當培養(yǎng)液顏色從紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，這表明pH值下降了，此時就應(yīng)當進行更換。每一次操作完成之后，要記錄下細胞的代次、形態(tài)以及污染情況，倘若連續(xù)傳代超過二十代，那就需要重新復(fù)蘇原始凍存株。
細胞培養(yǎng)常見問題
可能致使細胞生長緩慢的緣由諸多，血清批次存在差異，培養(yǎng)基的pH值不正確，接種密度過低。建議針對每一批新的血清開展增殖測試，使用pH計校準培養(yǎng)基。若細胞浮游而不貼附于壁面，需檢查培養(yǎng)皿是否經(jīng)過TC處理，或者基質(zhì)蛋白包被是否不足。若出現(xiàn)具黑點且能作蠕動狀的情況，多半是細菌受到污染，若顆粒呈現(xiàn)靜止不動的狀態(tài)，可能是細胞碎片。細胞老化體現(xiàn)為胞體變大，顆粒增多，增殖陷入停滯，唯有及時復(fù)蘇低代次細胞方可解決問題。遭遇異常狀況應(yīng)優(yōu)先于鏡下進行確認，切勿盲目添加抗生素，因為那會將真實的原因予以掩蓋。
成功把控住細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵核心控制點，涵蓋無菌狀態(tài)的操作，以及設(shè)備的維護保養(yǎng)，還有進行關(guān)于細節(jié)方面的優(yōu)化，如此這般便能夠培養(yǎng)出情況穩(wěn)定呈現(xiàn)較佳狀態(tài)的細胞。你于細胞培養(yǎng)行動進程當中遇見經(jīng)歷過種類屬于哪一種的那些最為令人頭疼不已的污染狀況情形呢？
