細(xì)胞培養(yǎng)，作為生物實(shí)驗(yàn)室里極為基礎(chǔ)且特別核心的技術(shù)當(dāng)中的一項(xiàng)，其含義是在人工加以控制的條件之下，使得細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)生長(zhǎng)與繁殖。不管是蛋白的表達(dá)，還是病毒的擴(kuò)增，均需仰仗穩(wěn)定且可靠的培養(yǎng)體系。就在今天，依據(jù)多年實(shí)際操作所積累的經(jīng)驗(yàn)，來(lái)談?wù)撃切┤菀妆蝗藗兒鲆暤珜?shí)則至關(guān)重要的細(xì)節(jié)。
細(xì)胞培養(yǎng)需要哪些基本條件
首要前提是無(wú)菌環(huán)境，超凈工作臺(tái)在使用之前，要進(jìn)行紫外照射三十分鐘，并且要用酒精擦拭臺(tái)面。培養(yǎng)液需要含有氨基酸，還需要含有維生素、無(wú)機(jī)鹽以及生長(zhǎng)因子，哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用的是 DMEM 或 RPMI - 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。溫度要嚴(yán)格被控制在 37℃，CO2 濃度要維持在 5%，以此來(lái)調(diào)節(jié) pH 值，酚紅指示劑顯示淡紅色才是正常狀態(tài)。
對(duì)于水質(zhì)而言，得用超純水亦或是去離子水才行，要防止重金屬以及細(xì)菌內(nèi)毒素造成干擾。貼壁細(xì)胞的話，得要有經(jīng)過表面處理的培養(yǎng)瓶，只有帶正電荷才能夠良好地附著。血清一般添加10%的胎牛血清，不過根據(jù)細(xì)胞類型是可以調(diào)整比例的。所有像移液管、離心管這樣的耗材，都需要進(jìn)行滅菌或者使用一次性無(wú)菌產(chǎn)品。
如何防止細(xì)胞培養(yǎng)污染
表現(xiàn)為培養(yǎng)基快速變黃且渾濁、伴有酸臭味現(xiàn)象的事物是細(xì)菌污染，呈現(xiàn)出絮狀菌絲狀況的則為真菌。預(yù)防這些污染的首要原則乃是嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作，在操作之前，需用75%酒精去擦拭雙手以及臺(tái)面，器材開口之后要迅速采用火焰滅菌或者立即予以使用。那種在培養(yǎng)基里添加雙抗的做法，僅僅能夠抑制部分雜菌而已，絕對(duì)不可以替代規(guī)范操作。
支原體污染不容易被察覺出來(lái)，需要每個(gè)月采用PCR法去檢測(cè)培養(yǎng)上清。交叉污染一般是源自于同時(shí)對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行操作，每一種細(xì)胞系都應(yīng)該使用獨(dú)立的移液管以及培養(yǎng)基，防止共用。一旦發(fā)現(xiàn)污染瓶要馬上進(jìn)行隔離，使用84消毒液處理臺(tái)面和培養(yǎng)箱的內(nèi)壁，情況嚴(yán)重的時(shí)候要解凍新批次的細(xì)胞然后重新開始。
細(xì)胞傳代與凍存的正確方法
貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)融合至80% - 90%那一刻就不得不迅速傳代。要是不傳代，就怕接觸抑制會(huì)致使加速老化。首先要把舊培養(yǎng)基吸棄掉，接著用PBS緩沖液清洗兩次，以此清除殘留血清。隨后，要加入0.25%胰蛋白酶 - EDTA消化液，在37℃的環(huán)境中孵育1 - 3分鐘。當(dāng)在顯微鏡下看到細(xì)胞變圓，并且開始脫離瓶底的時(shí)候，要在當(dāng)下毫不遲疑地用含血清培養(yǎng)基去終止消化。然后輕輕地吹打，使得制成單細(xì)胞懸液，按照1:3的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶當(dāng)中。
對(duì)于凍存，要配制含有百分之十DMSO的凍存液，采用梯度降溫方式，先是在四攝氏度放置三十分鐘，接著在零下二十?dāng)z氏度放置一小時(shí)，然后在零下八十?dāng)z氏度過夜，之后再轉(zhuǎn)入液氮罐。而復(fù)蘇時(shí)，要快速?gòu)囊旱幦〕?，在三十七攝氏度水浴進(jìn)行融化，馬上加入預(yù)熱后的培養(yǎng)基用以稀釋DMSO，經(jīng)過離心去除凍存液之后再去接種。每一次操作都要記錄細(xì)胞代數(shù)、凍存日期以及類型，良好的傳代習(xí)慣可以讓細(xì)胞長(zhǎng)久維持穩(wěn)定狀態(tài)。
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