平日里，有一位被我稱作朋友的老趙，任職于一家開展生物技術相關業(yè)務的公司，其職責側重在研發(fā)領域，而他日常主要擔任的任務，乃是去進行基因表達定量方面的分析工作。
可以說，他每天的實驗都離不開qPCR儀和各種試劑盒。
要是你也曾進行過相似的實驗，那么這篇文章你絕對得看完，原因在于老趙所遭遇過的那些坑，極有可能你當下也正處于經歷之中。
qPCR實驗如何避免重復性差
老趙在這行干了快六年，算是經驗豐富的老手。
然而，就在今年的四月份，他承接了一項全新的項目，其內容是對不同物種細胞系當中的目標基因表達量進行檢測。
項目伊始便碰到怪異之事，針對同一物品樣本，進行了三次重復檢測，然而其CT值卻呈現(xiàn)出忽高忽低的狀況，并且標準差變得大得十分離譜。
在2025年4月7日的那個下午，他身處實驗室，從兩點開始折騰，一直持續(xù)到晚上九點，期間更換了三批樣品，然而結果依舊是雜亂不堪的狀態(tài)。
老趙目不轉睛地盯著qPCR儀屏幕，那屏幕上呈現(xiàn)出毫無規(guī)律可言的擴增曲線，他感覺如同置身于乘坐過山車的狀態(tài)之中。
起初，他對自身操作是否存在問題產生懷疑，隨后，他重新配置了體系，接著，他對移液器校準情況進行了檢查，甚至于，他更換了整盒全新的槍頭。
但數(shù)據(jù)依然像個不聽話的孩子，左蹦右跳。
隨后，他心生疑惑，覺得可能是儀器出現(xiàn)了故障，于是找來工程師，讓其進行一系列全面的檢測，然而，最終的結果顯示，儀器在各個方面都是正常的。
那幾日，老趙眉頭緊蹙，就連用餐之際，都在喃喃自語道：“難道是模板降解了不成？然而皆是新鮮提取出來的呀?！薄?/p>
后來他仔細復盤實驗過程，把矛頭指向了試劑盒。
他先前使用的那個試劑盒，其反轉錄效率于不同物種之間波動幅度極大，引物設計的通用性同樣不夠突出。
簡單說，就是試劑盒本身“挑食”，對某些樣品不友好。
通用RT-PCR試劑盒怎么選才靠譜
先是老趙著手于在網(wǎng)上查找資料，而后向同行進行詢問，最終將一款通用的RT - PCR試劑盒確定了下來。
他講，這款試劑盒，有一點最讓他心動，那就是，它采用了特殊修飾的熱啟動聚合酶，還有優(yōu)化的緩沖體系，并且，能夠兼容不同的模板結構。
在2025年4月15日，他拿到了試劑盒，就在當天下午，他把試劑盒拆開，去做驗證實驗。
他準備好了三個屬于不同物種的cDNA樣品，這些樣品全都使用同一批試劑盒，完全依據(jù)說明書的指示來操作：先是配制成反轉錄反應液，其次在42度的環(huán)境下進行孵育，時長為15分鐘，最后在85度的條件下進行滅活，時間是5秒。
接著拿反轉錄后得到的產物去進行qPCR，采用兩步法展開擴增，先是95度時進行預變性，時長為30秒，隨后95度進行變性，時長是10秒，再之后60度進行退火延伸，時長為30秒，總共歷經40個循環(huán)。
結果致使他的眼前陡然一亮，三個物種的擴增曲線近乎完美地相互重合，溶解曲線均呈現(xiàn)為單一的尖峰。
重復三次實驗，CT值標準差都在0.2以內。
老趙那時激動得幾乎要拍桌子，他講，“這種感受如同于黑暗里忽然瞧見了光?！薄?/p>
為什么這款通用RT-PCR試劑盒能表現(xiàn)這么好？
老趙仔細研究了技術資料，發(fā)現(xiàn)幾個關鍵點。
其一，它具備的逆轉錄酶，熱穩(wěn)定性相當出色，能夠承受高達55度的反應溫度，可有效地解開富含GC的RNA模板，還能解開具有復雜二級結構的RNA模板。
其二呢，試劑盒里頭預先混合了隨機引物以及oligo(dT)引物，這兩者共同發(fā)揮作用，將從5'端一直到3'端的全長轉錄本給涵蓋住了。
存在這樣一種情況，qPCR反應液當中添加了特別的被動參比染料，同時還添加了穩(wěn)定劑，不管儀器型號是否不同，數(shù)據(jù)都具備能夠進行橫向對比的特性。
通用RT-PCR試劑盒的多重檢測能力
老趙所負責的項目，在要求方面呈現(xiàn)出需同時對三個目標基因以及一個內參基因展開檢測的狀況，如此便觸及到了多重qPCR。
曾經，他運用普通試劑盒去做四重反應，老是會出現(xiàn)各種狀況，就是信號彼此之間產生干擾，且呈現(xiàn)出擴增效率并不均勻的問題。
尤其是熒光通道之間的交叉干擾，讓數(shù)據(jù)分析變得極不可靠。
換了通用RT-PCR試劑盒后，他特意做了多重檢測驗證。
在2025年4月23日的上午時分，他進行了一個四重反應體系的配置操作，對于每個基因，他都使用了有著不同熒光標記的探針。
做完擴增之后，四個通道所對應的曲線，全部都呈現(xiàn)出了良好的S型，閾值循環(huán)數(shù)并未出現(xiàn)明顯的漂移現(xiàn)象。
更令他感到驚喜的是，標準曲線的相關系數(shù)，全都處于0.998以上的范圍，擴增效率，則是在95%至102%這個區(qū)間之內。
這體現(xiàn)出試劑盒里頭經過優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)，以及專利校正染料，切實有效地處理好了多色熒光相互之間的串擾問題。
老趙講道，進行多重qPCR之時，最為懼怕的便是數(shù)據(jù)出現(xiàn)沖突的狀況，而當下的這個試劑盒，就好比是為每一個靶基因都專門設置了獨立行車通道，它們之間彼此不會產生干擾。
他另外發(fā)覺，這款通用類RT - PCR試劑盒，針對有著不同GC含量的模板，展現(xiàn)出高度相同的擴增效率。
哪怕針對的是那個GC含量高達75%的特定目標基因，也并未出現(xiàn)非特異性擴增的情況，也沒有出現(xiàn)引物二聚體。
通用RT-PCR試劑盒如何保障實驗成功
經歷了這次換試劑盒的波折，老趙總結了幾條實戰(zhàn)經驗。
有新批次試劑盒到手之后，要在最先的時間去做系統(tǒng)適應性驗證，不要盲目相信舊批次所擁有的數(shù)據(jù)。
反轉錄階段的步驟，必須嚴格按著說明書去把控時間以及溫度，特別是針對于具有高GC含量的模板而言，建議采取55度的反轉錄方式。
配置qPCR反應體系時，要盡可能在冰上進行操作，防止出現(xiàn)反復凍融的情況，試劑使用完畢后需馬上放回零下二十度保存。
每次進行實驗的時候，都需要進行設置，設置的內容是無模板對照以及無反轉錄對照，而這，恰恰是判斷試劑盒是不是被污染或者受到抑制的關鍵之所在。
做絕對定量時，標準品得用同一批試劑盒來進行連續(xù)梯度稀釋呢，千萬別用不同試劑盒去勉強湊合呀。
現(xiàn)有這么一個情況，老趙手頭的那個項目，目前已然順利地推進到了數(shù)據(jù)分析的階段，與此同時，多篇論文也正處于準備的進程當中。
之前他跟我講，曾以為試劑盒彼此間沒多大差別，只要能發(fā)揮作用便足矣，直至如今才明白，水準高的通用型RT - PCR試劑盒竟可使你在前行途中少繞那許多的歧途彎路。
要是你也碰到過，實驗重復性欠佳、多重檢測信號存在干擾、不同樣品擴增情況不一致這類狀況，那不妨如老趙那般，從試劑盒著手展開排查。
挑選出一款確實好用適用的通用型RT - PCR試劑盒，說不定能夠使得你的qPCR數(shù)據(jù)自此穩(wěn)定且可靠。
