前兩天，我的那位從事生物技術(shù)研發(fā)工作的老朋友阿杰，從上海虹橋打來了一通電話，其語氣之中，流露著一種劫后余生般的慶幸之情，他講道，最近終于成功地將項目推進(jìn)到了預(yù)實驗的階段，并且，在此之前，足足有三個月的時間，他以及團(tuán)隊，險些被一個表面望去并不起眼的小問題給拖垮！
阿杰在上海浦東的一家生物科技公司工作，負(fù)責(zé)免疫分析平臺的搭建，去年年底，他們承接了一個項目，項目內(nèi)容是對環(huán)境樣本中的痕量污染物進(jìn)行檢測，按照流程，第一步要做的是選擇合適的ELISA試劑盒，當(dāng)時他認(rèn)為這事容易，市面上數(shù)量眾多的牌子很多，隨便挑選一個口碑突出的不算是難事，結(jié)果，正是這個隨意的行為，讓他遭遇了一個嚴(yán)重的問題。
ELISA試劑盒怎么選
阿杰頭一回進(jìn)行采購之際，為圖省事挑選了某個價錢較為便宜的國產(chǎn)盒子 ，今年1月初 ，他于張江高科園區(qū)的實驗室里依據(jù)說明書展開操作 ，預(yù)實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)好不容易才達(dá)到0.98 ，他心里覺得還算可以 ，然而等到正式去測同一個批次的加標(biāo)樣本之時，問題顯現(xiàn)出來了 ，板內(nèi)變異系數(shù)超出了15% ，重復(fù)孔之間的吸光度值好似過山車那般忽高忽低。
他著手去排查致使結(jié)果糟糕的原因，其中移液器已經(jīng)校準(zhǔn)過，洗板機(jī)運行狀態(tài)亦是正常，孵育溫度借助恒溫箱被精準(zhǔn)控制在37度。他為此折騰了整整一周時日，期間更換了三批日期各異的樣本，然而最終結(jié)果仍舊不盡人意。隨后他撥通電話向廠家技術(shù)支撐進(jìn)行詢問，得到的回應(yīng)卻是支支吾吾，直至最后對方才坦承那批試劑盒的包被抗體在批次之間的穩(wěn)定性未能得到有效控制。
阿杰此刻才弄清楚，挑選ELISA試劑盒時不能夠僅僅依據(jù)價格以及品牌宣傳來抉擇。他梳理出了一條心得，必須去向廠家索要每一個批次的質(zhì)控報告，著重查看“板內(nèi)變異系數(shù)”及“板間變異系數(shù)”這兩項參數(shù)，依照原則來說分別要低于10%以及15%。此外，不要嫌麻煩，先購買小包裝去做預(yù)實驗進(jìn)行驗證，不要一開始就大批量地采購。
標(biāo)準(zhǔn)品濃度不準(zhǔn)怎么辦
換了另外一家供應(yīng)商所提供的產(chǎn)品之后，阿杰再度遭遇了全新的麻煩。在今年2月中旬這個時間段，他對某個加標(biāo)濃度設(shè)定為50pg/mL的樣本展開檢測，檢測出來的值始終呈現(xiàn)偏低的狀況，僅僅只有30左右。他把標(biāo)準(zhǔn)曲線反復(fù)做了三次，復(fù)孔之間的精密度展現(xiàn)得相當(dāng)良好，然而計算出來的樣本值卻偏偏是不正確的。
他將試劑盒當(dāng)中自帶的質(zhì)控品當(dāng)作樣本跑了一回，發(fā)覺質(zhì)控品的回收率僅僅只有72%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于說明書所宣稱的85%至115%。阿杰察覺到，問題出在了標(biāo)準(zhǔn)品上面。他拆開另外兩盒同批號尚未拆封的試劑盒，分別對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行復(fù)溶后重新標(biāo)定，發(fā)現(xiàn)不同盒子里的標(biāo)準(zhǔn)品活性竟然相差了20%。
那時他氣得相當(dāng)厲害，然而項目不能夠停止運行 ，他迅速地聯(lián)系了廠家 ，對方給出的建議是他去使用外購的獨立標(biāo)準(zhǔn)品用于校準(zhǔn)進(jìn)行操作 ，阿杰拜托朋友從杭州那個地方借來了一管經(jīng)過國家參考物質(zhì)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)品 ，回來以后重新去做標(biāo)曲方面的工作 ，然后再去測量原來的加標(biāo)樣本 ，回收率最后終于拉回到了90%左右。
這件事使得他記住了一項鐵律，那就是，于做準(zhǔn)確限定數(shù)量時，不要全然迷信試劑盒自身所帶的標(biāo)準(zhǔn)品，特別是特別情況之下，最好另外購置一套具備證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用作對照，經(jīng)由雙標(biāo)曲驗證方可安心。
樣本基質(zhì)干擾怎么消除
起初以為問題就到這兒了，沒料到三月份的時候又出現(xiàn)了個更為隱蔽的坑。阿杰手中所擁有的實際樣本是土壤浸提液以及地表水樣，其成分是復(fù)雜的。他直接拿著未經(jīng)處理的樣本去進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加標(biāo)回收率僅僅只有大概50%，并且隨著稀釋倍數(shù)的不斷增加，檢測值呈現(xiàn)出不成比例地下降態(tài)勢——這屬于典型的基質(zhì)抑制效應(yīng)。
他著手去查文獻(xiàn)，還詢問了中科院位于南京的某位師兄，這位師兄給出建議，讓他做“基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線”，阿杰依照此建議去做：選取同批次不含有待測物的空白基質(zhì)，采用基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級稀釋，并非使用說明書里提及的緩沖液，與此同時，他將所有樣本都實施了兩倍、五倍、十倍的稀釋操作，以此觀察稀釋線性。
有意思的是結(jié)果，兩倍稀釋后算出的濃度值和原液較為接近，然而五倍以上便嚴(yán)重偏離，這表明樣本里存在高濃度的干擾物，阿杰最終確定了一個折中方案，所有樣本統(tǒng)一進(jìn)行兩倍稀釋，而且每個樣本都做基質(zhì)加標(biāo)回收，如此一來，雖說多費了半天時間，但是數(shù)據(jù)的真實性與可靠性大幅提高了。
顯色結(jié)果不穩(wěn)定如何排查
四月上旬，阿杰所在的團(tuán)隊最終獲取了首批看來較為可靠的數(shù)據(jù)。只是在打算正式開展大樣本研究的前一日，實驗室里的恒溫孵育箱出現(xiàn)故障，臨時替換成了一臺舊的震蕩水浴鍋。次日進(jìn)行顯色操作時，所有孔呈現(xiàn)出的顏色相較于先前顯著變淺好多，標(biāo)曲的OD值在整體狀況下下降了一個等級。
阿杰趕忙進(jìn)行排查，察覺到水浴鍋的溫度分布并非均勻，靠近加熱管之處溫度高出了2度，邊緣位置又低了1.5度。在ELISA反應(yīng)里，酶催化的顯色步驟對于溫度極為敏感，相差一兩度便會致使反應(yīng)速率產(chǎn)生變化。他即刻叫停實驗，借用了隔壁實驗室的孵育箱重新開展，并且嚴(yán)格作出規(guī)定：所有孵育步驟必定要使用同一臺校準(zhǔn)過的恒溫設(shè)備，水溫或者氣溫的波動不超過0.5度。
同一時間，他留意到顯色時間也務(wù)必精準(zhǔn)。說明書標(biāo)明“室溫避光顯色十五分鐘”，然而上海四月份處于室溫狀態(tài)時上午與下午溫差可達(dá)四五度。他將顯色方式改為在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并且每一塊板子自加入底物液起始便借助計時器開始倒計時，時間一到馬上添加終止液，嚴(yán)格把控在正負(fù)三十秒范圍之內(nèi)。實施這些調(diào)整之后，批間重復(fù)性由原來的百分之二十降低至百分之八以內(nèi)。
數(shù)據(jù)超出量程怎么處理
阿杰在上周，對全部預(yù)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有十幾個高濃度樣本的OD值，已然超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點的吸光度?；诔Ｒ?guī)做法，這屬于“超出定量上限”，若直接報告“大于最高標(biāo)曲點”，是不專業(yè)的行為。他查閱了試劑盒的線性范圍，說明書標(biāo)稱的是15.6 - 1000pg/mL，然而他算出的樣本最高值有1800多。
阿杰做出了一項決定，要將所有超標(biāo)樣本再次進(jìn)行稀釋，使用樣本稀釋液制作兩倍、五倍、十倍這三個梯度，每個梯度都要做雙孔，接著從各梯度雙孔中，挑選出落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中段（也就是最好處于50% - 70%之間的濃度點）的那個稀釋倍數(shù)來進(jìn)行換算。他還專門對稀釋后的樣本，是否處在曲線范圍內(nèi)、回收率是否合格進(jìn)行了驗證。
而且，他察覺到存在少量樣本的OD值，甚至要比空白孔的數(shù)值還要低不少。這屬于典型的“鉤狀效應(yīng)”，鑒于樣本里待測物的濃度過高，從而反倒抑制了抗原抗體的結(jié)合情況。解決的辦法是增大稀釋倍數(shù)之后再去進(jìn)行測量檢測。阿杰將這類樣本重新做了五十倍的稀釋，果真得到了合乎情理的數(shù)值。
遭受三個多月的磕磕碰碰狀況，阿杰起初對ELISA試劑盒持有半信半疑的態(tài)度，直至如今能夠在閉眼的狀態(tài)下講出十幾個存在問題可能性的環(huán)節(jié)。他近期于朋友圈發(fā)布了一條動態(tài)，內(nèi)容為：“倘若你檢測出來的數(shù)據(jù)極為漂亮，反倒需要謹(jǐn)慎留意了?！彼Q，真正意義上的實驗高手并非一次便達(dá)成成功，而是明晰每一步驟有可能出現(xiàn)失誤的地方，并且預(yù)先將安全保障措施做好。
此時此刻，阿杰所在團(tuán)隊的項目最終順?biāo)焱ㄟ^了中期評審。他已將這段日子里全部的踩坑記錄整理成了一份內(nèi)部培訓(xùn)手冊，剛?cè)肼毜男峦略谑状芜M(jìn)行ELISA操作前，定然得先讀完這份堪稱“血淚史”的資料。阿杰講道，倘若讓他回歸到三個月以前的時光，他必定會對那時的自己這般說道：切勿嫌驗證試劑盒的流程繁瑣，切勿跳過基質(zhì)匹配這一環(huán)節(jié)，切勿忽視每一個溫度里那零點幾度的細(xì)微差別。這些看似微不足道的細(xì)節(jié)之處，最終都會呈現(xiàn)在你的數(shù)據(jù)之中。
