有一位叫老陳的朋友，我認(rèn)識(shí)他，他從事食品成分分析工作，于第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)工作了六年。
去年，他承接了一個(gè)項(xiàng)目，項(xiàng)目?jī)?nèi)容是對(duì)植物提取物抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估，原本覺得輕而易舉，可不料前前后后反復(fù)折騰，耗費(fèi)了將近半年時(shí)間。
不是樣品處理出現(xiàn)了問題，也不是儀器操作存在不熟練的情況，而是卡在了一個(gè)最為基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)，這個(gè)環(huán)節(jié)是生化試劑盒的選擇以及使用上。
后來(lái)，老陳跟我復(fù)盤，講那段日子簡(jiǎn)直如同在迷宮里來(lái)回打轉(zhuǎn)，明明是依照說明書一步步來(lái)做的，然而出來(lái)的數(shù)據(jù)，要么是飄忽不定，要么是平行樣本之間差異大得超乎想象。
今日，我會(huì)將屬于他的那段經(jīng)歷撰寫出來(lái)，渴望能夠?qū)φ柺苌噭┖欣_的友人予以助力。
生化試劑盒重復(fù)性差的原因
那個(gè)名為老陳的人的項(xiàng)目，起始時(shí)間是去年九月，其項(xiàng)目開展地點(diǎn)，位于蘇州工業(yè)園區(qū)內(nèi)的一家共享性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。
他存在檢測(cè)一批植物提取液總抗氧化能力的需求，挑選了一款于市面上較為常見出現(xiàn)且基于鐵離子還原法的生化試劑盒。
做預(yù)實(shí)驗(yàn)是首次，針對(duì)六個(gè)重復(fù)孔所測(cè)的吸光度值，其變異系數(shù)超出了百分之十五。
那次，老陳覺得是自己加樣時(shí)手法不夠熟練，于是又小心翼翼地重新做了一回，然而最終得到的變異系數(shù)竟然依舊是百分之十二。
他著手開展排查緣由的工作，具體涵蓋：試劑是不是新近進(jìn)行配制的，孵育時(shí)的溫度是不是保持穩(wěn)定的，酶標(biāo)儀有沒有完成校準(zhǔn)操作。
在這些均被確認(rèn)不存在差錯(cuò)之后，老陳撥打了電話給試劑盒廠家的技術(shù)支撐人員。與之相對(duì)的另一方詢問他，樣本是否開展了脫蛋白處理這一操作。
老陳出現(xiàn)了一愣的情況，說明書上面僅僅寫著“樣本需澄清”，他并沒有朝著脫蛋白那一個(gè)步驟去進(jìn)行思考。
嗣后，他憑著三氯乙酸沉淀法對(duì)樣本予以處理，而后又進(jìn)行測(cè)量，最終變異系數(shù)降至百分之八以內(nèi)這項(xiàng)事實(shí)是成立的。
老陳因這件事明白了這樣一個(gè)道理，生化試劑盒重復(fù)性差，在許多時(shí)候并非試劑盒自身的問題，而是樣本基質(zhì)對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生了干擾。
植物提取液之中存有大量的多酚，還有蛋白質(zhì)以及色素，這些物質(zhì)會(huì)徑直跟顯色劑產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。
因此，后來(lái)老陳形成了一種習(xí)慣，在拿到任何生化試劑盒之時(shí)，首先仔細(xì)查看說明書里的“樣本前處理”部分情況，查看其中是否存在針對(duì)特殊基質(zhì)的補(bǔ)充說明。
倘若不存在，他便會(huì)主動(dòng)去查與之相關(guān)的文獻(xiàn)，瞧瞧別人所用同類樣本之際究竟是怎樣予以處理的。
生化試劑盒如何選型號(hào)
老陳在這個(gè)項(xiàng)目上踩的第二個(gè)坑，是關(guān)于選型。
從起始階段他所運(yùn)用的那個(gè)試劑盒，其檢測(cè)范疇在于每毫升零點(diǎn)一至十毫摩爾當(dāng)量。
其樣本預(yù)估濃度處于兩毫摩爾大概之水準(zhǔn)，按道理來(lái)說處于檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，本應(yīng)是無(wú)問題的。
但在實(shí)際進(jìn)行測(cè)量得出結(jié)果時(shí)，高濃度的樣本所呈現(xiàn)的信號(hào)值直接達(dá)到了飽和狀態(tài)，而低濃度的樣本其信號(hào)值卻又十分貼近檢出限。
老陳始終想不明白，隨后通過采用稀釋梯度來(lái)開展了一輪預(yù)實(shí)驗(yàn)，這才發(fā)覺樣本相互之間濃度存在著極大的差異，濃度最高的那個(gè)樣本經(jīng)過稀釋二十倍之后才下降到線性區(qū)間的中部位置。
那位提供技術(shù)支撐的人跟他講了，在挑選生化試劑盒型號(hào)之際，不能夠僅僅去看檢測(cè)范圍所具有的上限，還得留意線性范圍實(shí)際呈現(xiàn)出的寬度。
有些試劑盒所標(biāo)稱的范圍無(wú)比寬泛，然而，其真正具備線性的部分，或許僅僅是中間的兩三個(gè)數(shù)量級(jí)。
有著老陳之稱的人，于后續(xù)階段學(xué)習(xí)到了一項(xiàng)技能，在正式開展實(shí)驗(yàn)以前，先行選取兩三個(gè)具備代表性的樣本，實(shí)施一倍、兩倍、四倍、八倍以及十六倍的梯度稀釋操作，接著再分別進(jìn)行測(cè)定。
針對(duì)所測(cè)得的值，將其針對(duì)稀釋倍數(shù)來(lái)開展回歸操作，去查看是否為經(jīng)過原點(diǎn)的一條直線狀。要是并非如此，那就表明樣本當(dāng)中存有著基質(zhì)效應(yīng)，又或者試劑盒的線性范圍沒辦法充分覆蓋濃度變化。
鑒于這個(gè)經(jīng)驗(yàn)，老陳于以后采購(gòu)生化試劑盒之際，都會(huì)向供應(yīng)商索取真實(shí)的批次質(zhì)檢報(bào)告，尤為關(guān)注線性相關(guān)系數(shù)與檢測(cè)限這兩個(gè)參數(shù)啦。
他另外加了一個(gè)跟行業(yè)相關(guān)的交流群，是在這個(gè)群里頭，有人曾分享過一份對(duì)比表格哪，這份表格可是羅列清楚了不同品牌、同一類型的試劑盒，于實(shí)際樣本當(dāng)中所呈現(xiàn)出來(lái)的表現(xiàn)情況那種，這樣子的做法相較于他只是一味盲目地去看說明書而言，那是要可靠得多的呀。
生化試劑盒質(zhì)控怎么做
去年十一月，老陳所負(fù)責(zé)的項(xiàng)目步入了正式的檢測(cè)時(shí)期，呈現(xiàn)出的數(shù)據(jù)看上去還算良好，然而他的內(nèi)心自始至終都未曾感覺到踏實(shí)。
因?yàn)樗麤]有設(shè)置任何質(zhì)控樣本，只做了空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
那位曾教導(dǎo)過他的導(dǎo)師表示，對(duì)于一個(gè)稱得上優(yōu)質(zhì)的生化試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，是必然需要涵蓋三套質(zhì)控內(nèi)容的，這三套質(zhì)控分別是試劑空白，樣本空白以及質(zhì)控品。
以不加樣本、僅添加緩沖液與顯色劑制成的試劑空白，其用途在于監(jiān)測(cè)試劑的本底有無(wú)出人意料的不正常情況。
樣本空白乃是樣本添加緩沖液卻不添加顯色劑里的關(guān)鍵底物，其作用是用以扣除樣本自身顏色所帶來(lái)的干擾。
存在這樣一種物質(zhì)，它是已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，叫做質(zhì)控品，它要和樣本進(jìn)行平行測(cè)定，，其目的在于驗(yàn)證整個(gè)操作流程是不是處于受控狀態(tài)。
起先，老陳曾有過偷懶行為，所做之事僅為試劑空白而已。而后，他耗費(fèi)一百多塊錢購(gòu)得一支具備證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。隨后，他將其與樣本一同進(jìn)行了一次操作流程。
結(jié)果發(fā)覺，質(zhì)控品的測(cè)定數(shù)值，相較于標(biāo)稱數(shù)值，低了百分之九，此情形超出了允許偏差的范圍。
他趕忙進(jìn)行排查，發(fā)覺原來(lái)是孵育的時(shí)間相較于說明書所要求的少了三分鐘，緣由在于那天他同時(shí)開展三個(gè)各異的生化試劑盒實(shí)驗(yàn)，時(shí)間沒能精準(zhǔn)卡住。
這個(gè)發(fā)覺致使老陳驚出一身冷汗，倘若他并沒有操作質(zhì)控品，那前面整整一周所測(cè)量的幾十個(gè)樣本都會(huì)全部被判定無(wú)效，并且還必須得再次進(jìn)行采樣。
從此往后，老陳于每一個(gè)檢測(cè)批次當(dāng)中，都會(huì)放進(jìn)低、中、高這三個(gè)濃度的質(zhì)控品，接著繪制質(zhì)控圖。
他專門去買了一個(gè)多通道定時(shí)器，針對(duì)每個(gè)試劑盒，其每一步反應(yīng)時(shí)間都進(jìn)行單獨(dú)的倒計(jì)時(shí)操作，如此一來(lái)便不再依靠手機(jī)鬧鐘了。
數(shù)據(jù)異常時(shí)的排查思路
老陳曾講過一句極具價(jià)值的話，是，使用生化試劑盒出現(xiàn)問題并非可怕之事，可怕之處在于不清楚該從什么地方著手去進(jìn)行查找。
他總結(jié)了一套排查順序，我聽了覺得特別實(shí)用。
瞅一瞅顏色的變化情況，要是空白孔呈現(xiàn)出的顏色相較于樣本孔而言更深，那么很大概率應(yīng)是試劑受到了污染，抑或是在孵育的過程中遭受到了光降解的影響。
觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)，要是其低于零點(diǎn)九九，那就表明標(biāo)準(zhǔn)品稀釋環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問題，又或者是加樣槍不準(zhǔn)確。
查看平行樣本的變異系數(shù)，若其超過百分之十，那么首先應(yīng)優(yōu)先懷疑加樣操作存在問題，其次才是懷疑樣本不均一。
查驗(yàn)質(zhì)控品的回收率，要是并非處于百分之八十五至百分之一百一十五這個(gè)范圍之內(nèi)，那就得思索樣本基質(zhì)帶來(lái)的干擾或者試劑已然失效的情況。
曾經(jīng)有一回，老陳碰到這般狀況，標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)不錯(cuò)，然而樣本重復(fù)性卻極其糟糕，就順著這個(gè)思路，他查找了三天時(shí)間。
最終發(fā)覺是樣本于凍融進(jìn)程當(dāng)中形成了絮狀沉淀，離心之后上清液看似澄清，實(shí)則顆粒物在微孔里沉降，致使每個(gè)孔的固體含量存在差異，有不一樣的情況。
他用濾膜過濾了樣本后重新測(cè)定，重復(fù)性馬上好了起來(lái)。
這件事使我察覺到，生化試劑盒實(shí)驗(yàn)的成功或失敗，情況往往并非取決于試劑盒自身，而是要看實(shí)驗(yàn)者對(duì)于樣本物理化學(xué)性質(zhì)的知曉程度處于何種狀況。
值得記住的三條經(jīng)驗(yàn)
老陳如今已然成為他們實(shí)驗(yàn)室里運(yùn)用生化試劑盒的操作能手嘞，新入職的同事碰到問題都會(huì)去尋他。
他把自己這半年走過的彎路總結(jié)成了三條鐵律，我覺得特別實(shí)在。
第一條千萬(wàn)別迷信說明書，說明書所寫乃普遍情形，而你的樣本始終存有自身的特殊性，要先開展稀釋梯度以及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，待確認(rèn)不存在基質(zhì)干擾之后再正式進(jìn)行上樣。
第二條質(zhì)控品并非成本，而是一種保險(xiǎn)，一瓶質(zhì)控品或許要幾百塊錢，然而它能夠助力你規(guī)避幾千塊乃至幾萬(wàn)塊的重復(fù)性勞動(dòng)。
第三條設(shè)立屬于自身的操作核查表。對(duì)于生化試劑盒的流程而言，常常存在著七八道步驟，每一步驟所對(duì)應(yīng)的時(shí)間以及溫度，只要稍微出現(xiàn)偏差，最終的結(jié)果那可是有著極大差異的。要將核查表給打印出來(lái)，在進(jìn)行每一步操作時(shí)就打一個(gè)勾，這樣相比僅僅依靠腦子去記憶可要可靠許多。
去年年末，老陳成功讓那個(gè)有關(guān)植物提取物的項(xiàng)目完成結(jié)題，在數(shù)據(jù)發(fā)布出去以后，客戶表現(xiàn)出了極為滿意的狀態(tài)，基于這種滿意，又為他引薦了兩個(gè)全新的項(xiàng)目。
每次，在他開啟生化試劑盒之前，他都會(huì)花費(fèi)十五分鐘，將樣本前處理方案書寫于實(shí)驗(yàn)記錄本之上，隨后才著手去做。
用他自己的話說，磨刀不誤砍柴工，前面慢一點(diǎn)，后面反而快。
寫到如此地步的這篇文章，期望能夠給予你某些啟示。要是你的實(shí)驗(yàn)也曾碰到過相似狀況，無(wú)妨嘗試一下老陳的這些辦法。
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