近段時(shí)間，與一位往昔老友重溫舊情，談及他歷經(jīng)的那持續(xù)兩年于實(shí)驗(yàn)室中所遭遇的險(xiǎn)阻，尤其在開展原代細(xì)胞相關(guān)工作的那段時(shí)期，那情形怎一個(gè)辛酸了得，十足都是血淚交織的過往啊！
他當(dāng)下所取得的成果挺好的，然而回想起當(dāng)初那持續(xù)了幾個(gè)月的零數(shù)據(jù)情形，心里依舊存有后怕之感。
把他的經(jīng)歷寫下來，寫成這篇文章，講述從零開始摸索的故事，相信會對正在做同樣事情的人有所幫助。
為什么第一次分離總是失敗
有個(gè)被叫做老李的朋友，他任職于一家生物技術(shù)公司，從事細(xì)胞生物學(xué)方面相關(guān)工作。去年三月份的時(shí)候，那家公司承接了一個(gè)新項(xiàng)目，此項(xiàng)目需要用到原代細(xì)胞。
以前老李所養(yǎng)的皆是細(xì)胞系，于傳代培養(yǎng)方面頗為得心應(yīng)手，遂認(rèn)為原代細(xì)胞應(yīng)當(dāng)也并非有何了不起之處。
結(jié)果第一次操作就翻車了。
在2025年4月中旬的時(shí)候，他著手從動物組織進(jìn)行分離工作，為此忙碌了一整個(gè)白天，等到最后通過顯微鏡進(jìn)行觀察的時(shí)候，他卻傻眼了，你猜怎么著，細(xì)胞幾乎不存在貼壁的情況，有的處于飄著的狀態(tài)，有的則是死掉了的狀態(tài)。
老李說，當(dāng)時(shí)他整個(gè)人都是懵的。
事后再三反復(fù)進(jìn)行復(fù)盤，這才能夠發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞跟細(xì)胞系全然是屬于兩個(gè)不同的世界。細(xì)胞系已然適應(yīng)了體外的環(huán)境，無論怎樣去折騰它，它都能夠存活下來，然而原代細(xì)胞剛剛從組織當(dāng)中脫離出來，其極度具備敏感性，任何一個(gè)環(huán)節(jié)一旦出現(xiàn)問題，便都會引發(fā)失敗的結(jié)果。
每的濃度，以及，消化時(shí)間，還有，離心轉(zhuǎn)速，包括，培養(yǎng)基成分，這些參數(shù)，全都，需要，重新，摸索。
如何選擇合適的組織來源
老李的第二個(gè)坎，是組織來源的選擇。
五月上旬的時(shí)候，他進(jìn)行了另外一種組織的嘗試，此次貼壁的狀況好了許多，然而長出來的細(xì)胞形態(tài)并非典型的那種，還夾雜了數(shù)目不少的其他種類的細(xì)胞。
他向隔壁實(shí)驗(yàn)室的張博進(jìn)行了詢問，張博從事原代細(xì)胞工作已有好幾年時(shí)間，張博所說的一句話使他猛然醒悟，那就是：不同組織的細(xì)胞特性全然不同，你應(yīng)當(dāng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ヌ暨x最為合適的來源，絕不能夠隨意選取一塊組織便開展實(shí)驗(yàn)。
老李這才有所察覺，原代細(xì)胞究竟成不成功，在很大的程度方面取決于起始材料的質(zhì)量狀況。
他著手去查閱文獻(xiàn)，就自己所需要使用的細(xì)胞類型而言，尋覓到最為常用的組織來源。像某些細(xì)胞得從新生動物的組織當(dāng)中獲取，緣由是細(xì)胞活性更為高些；另外一些細(xì)胞卻需要特定周齡的動物，以此來確保細(xì)胞特性穩(wěn)定。
那段日子里，他每日都去翻動文獻(xiàn)，并且做筆記，僅僅是關(guān)于組織來源這一方面的記錄，就撰寫了幾十頁。
原代細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基怎么配
培養(yǎng)基的配方，是老李踩的第三個(gè)坑。
六月份，他依照一篇文獻(xiàn)里的配方配制了培養(yǎng)基，然而細(xì)胞生長得極為緩慢，在進(jìn)行傳代一次以后基本上就不再生長了。
他是后來才明白的，原代細(xì)胞的營養(yǎng)需求要比細(xì)胞系復(fù)雜得多。細(xì)胞系能夠憑借商業(yè)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上少許血清就生長得很不錯(cuò)，然而原代細(xì)胞卻需要添加各類生長因子、激素、維生素等成分。
有些生長因子非常昂貴，但缺了它們細(xì)胞就是長不好。
先去購買商業(yè)化成熟的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，這是老李的做法，盡管成本會高一些，然而至少能夠使細(xì)胞狀態(tài)維持穩(wěn)定。等他將細(xì)胞特性摸清楚以后，再試著自己進(jìn)行配制，通過逐步替換里面的成分以此來降低成本。
整個(gè)過程耗費(fèi)了差不多兩個(gè)月的時(shí)間 ，然而每一個(gè)步驟都存在著記錄 ，細(xì)胞在什么樣的濃度之下生長態(tài)勢良好 ，在何種條件當(dāng)中細(xì)胞分化的情況較少 ，所有這些內(nèi)容都被書寫得明明白白。
無菌操作的關(guān)鍵細(xì)節(jié)
七月份的一次污染事故，讓老李重新審視了自己的無菌操作。
那一天，他完成了分離操作，在顯微鏡下查看細(xì)胞狀態(tài)，覺得狀況良好，內(nèi)心還蠻開心的。然而，第二天一大早抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室，卻發(fā)覺培養(yǎng)液變得渾濁了，原來是遭受了細(xì)菌污染。
整整一天的工作白費(fèi)了。
他極其認(rèn)真地去回想操作的整個(gè)過程情況，發(fā)覺有可能是在對組織進(jìn)行剪碎這個(gè)步驟的時(shí)候出現(xiàn)了差錯(cuò)。剪刀以及鑷子雖說曾經(jīng)經(jīng)過了火焰的處理，然而組織塊在空氣范圍之內(nèi)暴露的時(shí)長實(shí)在是過久了。
自那之后，他形成了幾個(gè)習(xí)慣，所有器械于使用之前維持高溫滅菌狀態(tài)，操作之際盡力縮減組織在敞口容器里的停留時(shí)長，每完成一個(gè)步驟便采用酒精擦拭臺面，培養(yǎng)液當(dāng)中常規(guī)添加雙抗，雖說這并非常規(guī)做法，然而對于原代細(xì)胞培養(yǎng)來講，多一層保障總歸是有益處的。
老李講，對于那個(gè)無菌操作之舉，曉得是其一碼事，能做得到位則完全是另一碼事。重點(diǎn)在于要能夠比常常所想再多想那么一步，去預(yù)先判斷究竟何處有可能會出現(xiàn)問題。
細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測怎么做才算準(zhǔn)
八月中旬，老李卡在了細(xì)胞計(jì)數(shù)這一步。
他每回分離出來的原代細(xì)胞數(shù)量都欠缺穩(wěn)定性，活力檢測的結(jié)果亦是高低不定，明明在鏡下瞧著有不少細(xì)胞，可一計(jì)數(shù)卻發(fā)覺數(shù)量根本不足。
后來，他前往參加了一場技術(shù)交流會，去聆聽同行們分享經(jīng)驗(yàn)，這才曉得在計(jì)數(shù)之前，得運(yùn)用特定的染液去標(biāo)記死細(xì)胞，之后再借助自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來讀數(shù)，如此一來比人工計(jì)數(shù)可要穩(wěn)定許多。
并且，原代細(xì)胞極易于吹打進(jìn)程里邊遭受損害，因而呢，重懸細(xì)胞之際的力度需要把控妥當(dāng)，切不可過于猛烈，同樣不可太過輕柔致使細(xì)胞聚集成團(tuán)尚未分散開來。
回來后的老李調(diào)整了做法，準(zhǔn)備去計(jì)數(shù)時(shí)，每次都要先稍稍用力地吹打大概20次，以此來保證細(xì)胞懸液處于均勻狀態(tài)?；盍z測采用的是臺盼藍(lán)染色法，其中染成藍(lán)色的是死細(xì)胞，而活細(xì)胞呈現(xiàn)透明狀，于計(jì)數(shù)板上按照四個(gè)大方格去求取平均值，只有誤差被控制在5%以內(nèi)，這樣的數(shù)據(jù)才算得上是合格的。
凍存和復(fù)蘇的時(shí)機(jī)把握
到了九月份，老李終于培養(yǎng)出了一批狀態(tài)不錯(cuò)的原代細(xì)胞。
他的問題變成了：應(yīng)該在第幾天凍存？凍存液用什么配方？
原代細(xì)胞的凍存時(shí)機(jī)相較于細(xì)胞系而言挑剔許多，細(xì)胞系能夠在長至90%融合度時(shí)再進(jìn)行凍存，然而原代細(xì)胞常常需要于指數(shù)生長期、細(xì)胞尚未完全長滿之際來凍存。
老李所擁有的經(jīng)驗(yàn)是，在傳代之后呢，第三日直至第五日這個(gè)時(shí)間段，細(xì)胞是處于對數(shù)生長期的，而就在這個(gè)時(shí)候，其凍存的效果是最為良好的。凍存液采用的是90%的血清再加上10%的二甲基亞砜，要進(jìn)行梯度降溫，先是放置在4度的環(huán)境中長達(dá)半小時(shí)，之后又放置在負(fù)20度的環(huán)境里持續(xù)兩小時(shí)，最終，則是轉(zhuǎn)移至液氮罐當(dāng)中進(jìn)行長期存放的。
復(fù)蘇之際需更加謹(jǐn)慎考量，于從液氮之中取出之后，要疾速在37度的水浴之內(nèi)搖晃以便解凍，限定在一分鐘之內(nèi)務(wù)必達(dá)成，隨后迅捷使之添加到預(yù)先熱好的培養(yǎng)基里頭，通過離心操作去除二甲基亞砜，再行全新接種，這可不是一件容易的事兒?。?/p>
液氮里取出后，他有過一次動作遲緩的經(jīng)歷，那次細(xì)胞復(fù)蘇率僅在30%左右。后續(xù)嚴(yán)格依照流程操作，復(fù)蘇率則可達(dá)到80%以上。
從失敗到穩(wěn)定的真實(shí)感悟
老李講道，而今回想那半年的過往經(jīng)歷，每一步仿若都似在進(jìn)行走鋼絲這項(xiàng)活動。原代細(xì)胞培養(yǎng)不存在捷徑可尋，就是循序漸進(jìn)地去嘗試，將每一個(gè)參數(shù)均探究明白。
他專門拿來一個(gè)本子，用以記錄每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)，這些細(xì)節(jié)包含組織來源的動物周齡，運(yùn)輸時(shí)至處理時(shí)的時(shí)間間隔，消化酶的濃度以及處理時(shí)間，離心力與離心時(shí)間，接種密度，首次進(jìn)行換液的時(shí)間，培養(yǎng)基的批次號。
現(xiàn)如今，公司新入職的同事開展原代細(xì)胞培養(yǎng)工作時(shí)，皆去找老李求取教誨。他時(shí)常掛在嘴邊的一句話為：原代細(xì)胞跟細(xì)胞系之間最大的差異為，它留存了體內(nèi)細(xì)胞的大部分特性，因而它更為嬌弱，并且更具備花時(shí)間予以研究的價(jià)值。
要是你同樣在進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，期望老李的這般經(jīng)歷能夠給予你些許參考。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的條件存在差異，他人的方法不見得全然適用，不過思考問題的角度以及解決問題的思路卻是相通的。持續(xù)堅(jiān)持下去，總歸會尋覓到契合自身的那一套流程。
要是你期望知曉更多有關(guān)原代細(xì)胞培養(yǎng)的詳情，那么歡迎收藏這篇文稿，往后碰到具體的議題時(shí)能夠隨時(shí)將其翻出來瞧瞧。
