在去年的年末時(shí)分，我邀約了身為老同學(xué)的李工去用餐。他任職于一家從事生物科技領(lǐng)域的公司，擔(dān)當(dāng)著研發(fā)主管這一職位。平常情況下他話語(yǔ)并不過(guò)多，然而一旦談?wù)摰焦ぷ鞣矫?，他的眼睛立刻就明亮起?lái)了。那家公司主要致力于病原體檢測(cè)類產(chǎn)品展開(kāi)開(kāi)發(fā)工作，他所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)承擔(dān)著核心的擴(kuò)增環(huán)節(jié)予以優(yōu)化的任務(wù)。
“最近壓力大嗎？”我看他黑眼圈有點(diǎn)重。
他露出了一絲苦笑，說(shuō)道：“別去說(shuō)了。項(xiàng)目在擴(kuò)增時(shí)間這個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問(wèn)題。客戶期望速度要快，因?yàn)榕R床樣本沒(méi)有時(shí)間等待，然而我們現(xiàn)有的試劑體系，從對(duì)樣本進(jìn)行處理一直到得出結(jié)果，總共非要兩三個(gè)小時(shí)。競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手當(dāng)中有的已經(jīng)能夠把PCR的時(shí)間控制在一小時(shí)以內(nèi)了。我們嘗試了好幾種市面上號(hào)稱‘快速’的試劑盒，要么是速度提升上去了，可是靈敏度卻大幅下降；要么是穩(wěn)定性存在不足，批間差大到根本沒(méi)法看?！?。
他輕抿了一口茶，隨后說(shuō)道：“你要曉得，就我們從事的這個(gè)行業(yè)而言，‘快’并非單獨(dú)的唯一衡量標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增的效率如何，抗干擾的能力怎樣，以及結(jié)果之一致性怎樣，哪一項(xiàng)都均不可做出犧牲。在那段時(shí)期之內(nèi)，團(tuán)隊(duì)每日都于實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行如同‘烤’管子這般的操作，更換不一樣的酶，去調(diào)整緩沖系統(tǒng)，然而產(chǎn)生的效果始終是不太理想的。老板所給予的時(shí)間范圍，那時(shí)只剩下一個(gè)多月了！”。
快速PCR擴(kuò)增試劑盒的核心指標(biāo)有哪些？
李工所承受的壓力，眾多身處研發(fā)一線的朋友都是明白的。時(shí)間十分緊迫，任務(wù)相當(dāng)繁重，然而在選擇試劑盒時(shí)絕不能夠僅僅去看宣傳頁(yè)上面所寫的“快速”這兩個(gè)字。他在后來(lái)進(jìn)行總結(jié)時(shí)指出，關(guān)鍵需看幾個(gè)硬性指標(biāo)：其一，是關(guān)于擴(kuò)增速度方面，是否確實(shí)是在確保循環(huán)效率的情形下，縮短了每一個(gè)循環(huán)所耗費(fèi)的時(shí)間；其二，是靈敏度與檢測(cè)限，提升速度不能夠以犧牲對(duì)于低拷貝數(shù)模板的檢出能力作為代價(jià)；其三，是耐受性，在面對(duì)血液、痰液等復(fù)雜樣本所含抑制劑時(shí)，其表現(xiàn)能夠保持穩(wěn)定；其四，是擴(kuò)增特異性，出現(xiàn)的非特異性條帶或者引物二聚體會(huì)對(duì)結(jié)果判讀產(chǎn)生直接影響。
李工回憶說(shuō)，那時(shí)候，我們實(shí)在是過(guò)于著急了，僅僅只是一味緊盯著那個(gè)“快”字，對(duì)于試劑盒方面，有些是采用了具備超高速的酶的，然而熱啟動(dòng)的性能卻并不優(yōu)良，極易產(chǎn)生并非特異的擴(kuò)增現(xiàn)象，背景信號(hào)還特別高，這樣一來(lái)反而致使結(jié)果分析的難度有所增加了。不但如此，還有些試劑盒為了能夠去追求速度，大幅度地提高了鎂離子的濃度，這種情況對(duì)于某些基因靶點(diǎn)而言或許是適用的，可一旦換作另外一個(gè)項(xiàng)目，就極有可能會(huì)出現(xiàn)引物二聚體的狀況，如此一來(lái)實(shí)驗(yàn)就不得不再次重新進(jìn)行了。
如何評(píng)估快速PCR試劑盒的穩(wěn)定性？
遭受諸多吃虧狀況之后，李工所在團(tuán)隊(duì)，針對(duì)評(píng)估策略作出了調(diào)整，他們進(jìn)而決定采用一套更為系統(tǒng)的測(cè)試方法。
他提到，用了已作全然匿名化處置的同一批臨床殘留樣本，對(duì)五六種包含目標(biāo)病原體在內(nèi)的常見(jiàn)靶點(diǎn)進(jìn)行了選擇測(cè)試，2025年3月，他們于公司實(shí)驗(yàn)室著手開(kāi)展了為期兩周的集中評(píng)測(cè)，此外，除了設(shè)置常規(guī)的陽(yáng)性、陰性對(duì)照，還特意安排了不同濃度梯度的模板進(jìn)而模擬低載量樣本，同時(shí)，于反應(yīng)體系里添加了不同比例的血紅蛋白或肝素這種常見(jiàn)的PCR抑制劑以此考驗(yàn)試劑的抗干擾能力。
更為關(guān)鍵的是批間差測(cè)試，李工著重指出，真正的穩(wěn)定并非一次試驗(yàn)取得成功，而是在不同的時(shí)間，不同的人，使用不同試劑批次的情況下，且由不同的實(shí)驗(yàn)員在同一天運(yùn)用同一臺(tái)儀器進(jìn)行操作時(shí)，Ct值的變異系數(shù)（CV）能夠始終維系在極小的范圍之內(nèi)，我們訂購(gòu)了三個(gè)不同批次的試劑。
那段時(shí)間，他辦公室的白板上畫滿了各種數(shù)據(jù)的對(duì)比圖表。
哪款快速PCR擴(kuò)增試劑盒兼顧了速度與性能？
在經(jīng)歷了多輪對(duì)比的“盲測(cè)”之后，存在一款試劑盒，其表現(xiàn)進(jìn)入了他們所關(guān)注的范圍。李工未公開(kāi)具體的品牌，不過(guò)分享了它具備的幾個(gè)顯著特性：它使用了一種經(jīng)過(guò)工程化改良的熱啟動(dòng)DNA聚合酶，一方面有著快速的激活速度，另一方面維持著高保真性。其配套的緩沖體系經(jīng)過(guò)特別優(yōu)化，含有能夠有效中和常見(jiàn)抑制成分的物質(zhì)，并且一直保持著離子強(qiáng)度的穩(wěn)定。
“最令我們留有深刻印象的是其均一性?！崩罟ぶv道， “不管是高濃度的模板或者是接近檢測(cè)限的模板，擴(kuò)增曲線都又峻峭切整齊一致，重復(fù)的孔之間的Ct值差異微小。這在定量實(shí)驗(yàn)里是至關(guān)重要的?！?。
就在速度方面而言，這款試劑盒把標(biāo)準(zhǔn)的PCR循環(huán)時(shí)間給縮短了大概40%，如此一來(lái)，從加樣開(kāi)始到完成擴(kuò)增的整個(gè)總時(shí)長(zhǎng)被控制在了50分鐘之內(nèi)，并且不需要去購(gòu)買特殊的快速PCR儀，可以在常規(guī)設(shè)備上實(shí)現(xiàn)運(yùn)行。
使用快速PCR試劑盒有哪些實(shí)操技巧？
選用試劑盒僅僅是起始的一步工作，李工引導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)于后續(xù)的工藝轉(zhuǎn)變進(jìn)程里同樣積攢了某些體會(huì)。
“首先呈現(xiàn)的是分裝這一環(huán)節(jié)?！彼o出建議表明，大包裝的試劑盒在收取之后呢，應(yīng)當(dāng)依據(jù)日常實(shí)驗(yàn)所需要使用的量來(lái)進(jìn)行小管分裝操作，以此來(lái)降低反復(fù)凍融對(duì)于酶活性所產(chǎn)生的影響。“其次涉及到的是預(yù)混液的配制過(guò)程?！彼麄儼l(fā)覺(jué)，把引物、探針（要是屬于qPCR這類情況的話）率先與緩沖液、酶等調(diào)配成Master Mix預(yù)混液，這樣一來(lái)吶，不僅加樣的過(guò)程變得更加快捷，而且還能夠減少各孔之間在加樣方面出現(xiàn)的誤差，進(jìn)而達(dá)到提升重復(fù)性的作用。
李工補(bǔ)充說(shuō)，還有一點(diǎn)容易被忽略，那便是模板質(zhì)量，再好的試劑盒，也經(jīng)不住模板降解甚或抑制劑含量過(guò)高 ，對(duì)于難處理的樣本，前處理步驟的優(yōu)化得跟擴(kuò)增步驟聯(lián)動(dòng)起來(lái)考量 ，有時(shí)，在核酸提取這個(gè)環(huán)節(jié)稍微做些改良，便能使后續(xù)的PCR結(jié)果有質(zhì)的飛躍。
快速PCR技術(shù)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)是什么？
李工因這次經(jīng)歷，對(duì)技術(shù)發(fā)展有了全新認(rèn)識(shí)，他談道，單純的“快”已成基礎(chǔ)需求，且未來(lái)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)必然是集成化與智能化的，當(dāng)下現(xiàn)有產(chǎn)品正探索把樣本裂解、核酸純化以及擴(kuò)增檢測(cè)整合于一個(gè)小小的芯片或者卡盒之中，達(dá)成“樣本進(jìn)，結(jié)果出”的效能，與此同時(shí)，借助算法去優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，令同一款試劑能夠更為智能地適配不同來(lái)源、不同質(zhì)量的模板，進(jìn)而削減人工優(yōu)化產(chǎn)生的成本。
李工做了如下的總結(jié)，對(duì)于身為開(kāi)發(fā)者的大家而言，挑選一款具備可靠性的快速PCR試劑盒，就如同尋覓到了一處極為堅(jiān)實(shí)的地基，它可以使我們將更深層次的精力匯聚于引物探針設(shè)計(jì)以及應(yīng)用場(chǎng)景開(kāi)發(fā)這類更具價(jià)值的事務(wù)之上，而并非整日與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)所出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行“搏斗”。
那次飯局過(guò)后不久 ，姓李的工程師告知我 ，他們依據(jù)選定好的試劑盒予以優(yōu)化生成的新方案 ，順利地通過(guò)了內(nèi)部評(píng)審 ，項(xiàng)目的進(jìn)度追趕了上來(lái)。最近得知 ，他們所研發(fā)的新產(chǎn)品已然進(jìn)入了注冊(cè)檢驗(yàn)的階段。
故事于他，令我所想，于這個(gè)時(shí)代講究追求效率而言，就研發(fā)與生產(chǎn)來(lái)講，工具的選擇都有著至關(guān)重要的意義。一款真正稱得上優(yōu)秀的工具，不但能夠提升速度，而且更能夠保障結(jié)果具備可靠以及穩(wěn)定的特性，得以讓專業(yè)工作者可以釋放創(chuàng)造力，籍此區(qū)攻克更具重要性的難題。尋找到那個(gè)平衡點(diǎn)，通常便是突破的起始。
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