一個做基因檢測的朋友，最近被“酶活性”搞得焦頭爛額
我存在一位被稱作老周的友人，處于長三角地區(qū)一家第三方生物檢測實驗室范疇內(nèi)擔(dān)任技術(shù)主管職務(wù), 專門針對細(xì)胞功能分析這一領(lǐng)域予以負(fù)責(zé)。該項工作開展了將近七年時間, 經(jīng)由其手里的樣本數(shù)量起碼也得有上萬份規(guī)模。按照一般常理推斷, 何種實驗他未曾見識過呢?
但今年三月份，他被一個“酶活性檢測”的項目卡了整整兩周。
有一家從事腫瘤早期篩查的初創(chuàng)客戶公司, 寄來的樣本數(shù)量不算多, 然而對于檢測結(jié)果的重復(fù)性以及線性范圍有著極高要求。老周起初并未予以重視, 隨手就采用了實驗室一直所使用的那款老牌試劑盒。結(jié)果第一批數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出來, CV（變異系數(shù)）飆升至15%以上, 就連基線都飄忽得極不合理。
酶活性檢測試劑盒怎么選才對？老周踩過的坑你未必知道
老周跟我在喝酒這個行為進行當(dāng)中的時候, 發(fā)起了吐槽, 宣稱在那兩周的時間段之內(nèi), 他幾乎是把實驗室里能夠進行更換操作的條件全部都更換了一遍, 具體情況如下: 孵育溫度從原本的37℃調(diào)整到了30℃, 反應(yīng)時間從起初的30分鐘延長到了60分鐘, 甚至于把樣品稀釋倍數(shù)由原來的10倍改變?yōu)?0倍。那么最終的結(jié)果又是怎樣的呢? 數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出的狀態(tài)依然是忽高忽低, 猶如乘坐過山車一般。
過后, 他安靜下來, 對事情進行重新審視, 發(fā)覺問題壓根不是出在操作方面, 而是出在試劑盒自身的配方邏輯上。
現(xiàn)如今, 市面上所售的酶活性檢測試劑盒中, 其核心原理不外乎是, 底物跟酶展開反應(yīng)之后, 生成了有色或者熒光產(chǎn)物, 接著借助吸光度亦或是熒光強度去實施定量。然而呢, 不同品牌的試劑盒, 于底物選擇方面, 在緩沖液體系這件事上, 以及穩(wěn)定劑配方這塊, 存在著極大的差異。其中有的試劑盒, 為了能夠延長保質(zhì)期, 運用了大量的防腐劑, 可反倒抑制了部分酶的活性；還有的試劑盒, 其底物濃度標(biāo)稱得非常高, 但實際上批次之間的差異大到了離譜的程度。
老周所擁有的那款較為老舊的試劑盒, 存在著稱得上典型的“底物不穩(wěn)定”狀況。對于同一塊96孔板而言, 位于左邊的孔與處于右邊的孔, 它們各自的反應(yīng)速率并不相同, 如此一來數(shù)據(jù)當(dāng)然也就沒辦法得以觀瞧了。
換了個試劑盒之后，老周的數(shù)據(jù)終于穩(wěn)住了
清明節(jié)過后, 老周最終拿定主意更換試劑盒, 他挑選了三個品牌去做平行對比, 最后留下了一款國產(chǎn)品牌的新品, 這款試劑盒最大的特性是底物運用了微膠囊包埋技術(shù), 聽說能夠極大程度降低底物在溶液里的自發(fā)水解速率。
老周運用自身的標(biāo)準(zhǔn)酶開展了一組驗證, 存在五個濃度梯度, 進行了三次重復(fù) , 持續(xù)測定了三天。結(jié)果呈現(xiàn)出來, CV值全都控制在了3%以內(nèi) , 線性相關(guān)系數(shù)R2達到了0.999。他當(dāng)場就給客戶撥打了電話 , 告知可以重新進樣了。
客戶那方也十分地開心, 緣由是老周這次僅花費三天便給出了整套數(shù)據(jù), 并且每一組的重復(fù)性都完成得極為出色。還有, 對方實驗室的負(fù)責(zé)人后來特地打電話詢問老周所使用的是什么試劑盒, 同時表明他們自身內(nèi)部也正在尋覓穩(wěn)定的檢測方案。
酶活性檢測試劑盒的穩(wěn)定性到底有多重要？
你可能覺得，不就是個試劑盒嗎，能差多少？
我這般跟你講, 于酶活性檢測此領(lǐng)域, 穩(wěn)定性徑直決定你實驗結(jié)果能否被重復(fù)得出。一個不穩(wěn)定的試劑盒, 往輕了說會使你耗費多一周時間去做驗證, 往重了講則會徑直致使你整個實驗批次作廢。尤其在開展酶抑制劑的篩選實驗之際, IC50值的偏差有可能從納摩爾級直接躍至微摩爾級, 這般后果誰人能夠承受?
老周講, 他如今每回進入新一批次的試劑盒時, 首要之事乃是拿標(biāo)準(zhǔn)酶去做一回全流程驗證, 待確認(rèn)CV值處于可接受范圍之內(nèi)后才正式投入使用。這般習(xí)慣, 乃是被他上次那個出現(xiàn)問題的項目給逼迫形成的。
做酶活性檢測，別忽視說明書里的細(xì)節(jié)
老周跟我分享了個細(xì)節(jié), 他換上新試劑盒后, 仔細(xì)瞧了瞧說明書, 發(fā)覺這款試劑盒所推薦的稀釋液并非常見的PBS, 而是一種含有特定金屬離子的緩沖液。他進行了一次試驗, 果然靈敏度相較于使用PBS時提高了將近30%。
諸多進行檢測的人, 常常在獲取試劑盒之后按照自身經(jīng)驗去操作, 全然不去查看說明書之中的緩沖液配方, 不去留意反應(yīng)溫度，同樣也不關(guān)注終止液添加順序這類細(xì)節(jié)。然而恰恰就是這些細(xì)節(jié), 決定了你最終所得到的究竟是可靠的數(shù)據(jù), 還是如同廢紙一般毫無價值的東西。
哪怕是酶活性檢測試劑盒, 不同品牌的它對于樣本基質(zhì)的耐受能力也是存在差異的。一些試劑盒對于血清樣本內(nèi)部的脂質(zhì)格外敏感, 只要稍微呈現(xiàn)出些許渾濁狀態(tài), 吸光度就會偏離到極為離譜的程度。然而另外一些試劑盒借助優(yōu)化表面活性劑配方, 能夠直接承受高脂樣本, 可以無需進行樣品先前處理的時間操作。
最后說兩句
老周如今形成了一種習(xí)慣, 每間隔三個月, 他便會主動去聯(lián)系試劑盒供應(yīng)商, 詢問有無新的技術(shù)迭代或者是升級版。他認(rèn)為, 開展實驗這件事, 吃幾年現(xiàn)成的經(jīng)驗是可行的, 然而若想要始終得出高水平的數(shù)據(jù), 那就必須持續(xù)緊跟行業(yè)的技術(shù)發(fā)展進程。
要是你同樣正為酶活性檢測的穩(wěn)定性而犯愁, 那不妨跟老周那樣, 大大地去換個試劑盒嘗試一下。別害怕折騰一番, 之所以怕, 是因為你一直使用著不合適的工具, 還自認(rèn)為是自身的操作存在問題。
畢竟，工具選對了，事半功倍。
