就在上個月, 老張給我打了電話, 他的聲音之中帶著十分明顯的疲憊, 說道: “兄弟, 我那個實驗又不行了, 細胞株無論如何都養(yǎng)不活, 數(shù)據(jù)全都白白做了?！崩蠌埵俏蚁嘧R十年的朋友, 他在一家生物科技公司擔(dān)任研發(fā)主管, 負責(zé)腫瘤藥物篩選項目。他平常做事很沉穩(wěn), 能讓他如此崩潰的, 問題必定不小。
我向他詢問究竟是怎么一回事兒這一情況 , 他講自己挑選了一株在市面上屬于十分常見的腫瘤細胞株 , 原本以為它是那種所謂的 “萬能選手” , 可是呢最終出現(xiàn)的結(jié)果卻是實驗條件經(jīng)過了反反復(fù)復(fù)的調(diào)整改變這下 , 細胞卻始終就是不貼壁 , 而且其增殖速度慢得如同蝸牛遲緩爬行一樣極為緩慢。在歷經(jīng)一個月時間過去之后 , 項目的整體進度白白被拖延停頓下來一共有整整兩周這么長的時間 , 致使老板的臉色隨著時間一天接一天地推移變得越來越難看。
許多從事腫瘤研究的人, 都經(jīng)歷過世態(tài)萬象, 其中就有老張所身處的困境體現(xiàn)。腫瘤細胞株倘若挑選得適宜, 那么實驗便成功了一半；要是挑選得不盡人意, 那么時間、經(jīng)費以及精力就全都付諸東流了。今日, 我會借助老張的真切經(jīng)歷情況, 去談?wù)撘幌逻x用腫瘤細胞株之際那些容易踩到的坑, 以及他后續(xù)又是怎樣擺脫困境的。
腫瘤細胞株怎么選才不踩坑？
在最初的時候, 老張懷揣著的想法是極為簡單的, 那便是尋覓一株所謂的“經(jīng)典款”, 于網(wǎng)絡(luò)之上展開番搜索, 一旦瞅見名氣頗大的便徑直去下單。而后, 他挑選了一株細胞種類, 其來源的描述寫得是相當(dāng)模糊的, 聲稱是“通通普遍適用于各式各樣種類的腫瘤實驗”, 然而等拿到手過后才驚覺已然出現(xiàn)了問題, 具體表現(xiàn)為細胞的形態(tài)呈現(xiàn)出異常的狀況, 在培養(yǎng)液當(dāng)中處于漂浮狀態(tài)的細胞數(shù)量要比貼附在壁上的細胞數(shù)量更多, 在經(jīng)過PCR檢測之后發(fā)現(xiàn), 其標(biāo)志物的表達量和文獻里面所提及的數(shù)值相差了好幾倍之多。
他是后來才察覺到的, 挑選腫瘤細胞株并非是選衣物, 絕不能夠僅僅只瞅“爆款”。每一株細胞都必備自身的“身份證”, 這“身份證”涵蓋其來源組織、基因突變狀態(tài)以及倍增時間、對于藥物的響應(yīng)特征。倘若這些參數(shù)跟你的實驗設(shè)計不相契合, 最終所得結(jié)果便無疑是白忙活一陣。就好比你打算開展肺癌靶向藥方面的研究, 卻選用了一株KRAS野生型的細胞株,這情形跟用錯試劑盒毫無差別。
為什么有些腫瘤細胞株總是養(yǎng)不活？
有一株細胞在老張那兒被養(yǎng)活著卻是件困難之事, 他對此做了許多嘗試, 像是更換血清了, 調(diào)整二氧化碳濃度了, 甚至連培養(yǎng)瓶的品牌都給換了, 然而這些嘗試全都未見成效。之后他去尋求行業(yè)里一位老前輩的指點, 那位老前輩對他說了一句話, 正是這句話讓他如夢初醒: “你是否還未曾去查看有關(guān)這株細胞的STR鑒定報告呢? ”。
老張回去進行一番查看確證, 確實如此——這株細胞于傳代期間已然遭受污染, 其他細胞系業(yè)已混入其中。此類情形在該行業(yè)里并非鮮見: 某些來源難以明確的細胞株, 歷經(jīng)多次傳代之后出現(xiàn)交叉污染狀況, 表面看起來并無異常, 實際上基因背景早就發(fā)生改變。運用這樣的細胞去開展實驗, 就如同于沙堆之中尋覓金子, 即便找到最終也是虛假的。
因此, 挑選腫瘤細胞株之際, 務(wù)必要去確認賣家有沒有提供最新的STR鑒定報告, 最好是在三個月之內(nèi)檢測過的那種。超過半年未曾鑒定的細胞株, 就算是進口而來的, 也得留個心眼兒。
腫瘤細胞株傳代后為什么會變異？
隨后, 老張換了一樁經(jīng)得住考量的細胞, 實驗得出的結(jié)果最終趨于穩(wěn)定了。然而, 他又碰到了全新的問題——當(dāng)細胞傳代至第五代往后, 藥物響應(yīng)的IC50值猛地發(fā)生了變化, 跟先前的數(shù)據(jù)不相契合。起初, 他認定是操作方面出現(xiàn)了差錯, 連續(xù)重復(fù)了三次, 可結(jié)果均是如此。
隨后, 他向一位從事腫瘤細胞株資源庫管理工作的專家進行了請教, 那位專家作出解釋稱: 長久在體外進行培養(yǎng)時的腫瘤細胞株, 會因選擇壓力而出現(xiàn)基因漂變這種情況。簡單來講, 就是當(dāng)細胞于培養(yǎng)皿里停留較長時間后, 會“忘記”自己原本的特性, 進而開始適配體外環(huán)境。尤其是那些具備高倍增能力的細胞株, 在傳代到第十代往后以后, 其突變狀態(tài)也許已然和原始樣本全然不一樣了。
老張這下總算是弄清楚了, 究竟是為何有些文獻會要求在實驗當(dāng)中注明“使用第幾代細胞”。打那之后他確立了一個規(guī)矩, 每次拿到新細胞時, 首先要在液氮里面凍存數(shù)量足夠多的早期代次, 做實驗的時候僅僅使用第四代到第八代的細胞, 用完之后就再次進行復(fù)蘇, 絕對不會無限傳代。
不同腫瘤細胞株之間的耐藥性有區(qū)別嗎？
這個事, 是老張在項目到了后期的時候, 才切實弄明白的。那時, 他們要針對一款新的化合物, 去測試其對于胰腺癌所產(chǎn)生的效果, 選了兩種在胰腺癌腫瘤方面較常見的細胞株, 結(jié)果呢, 有一個對藥物呈現(xiàn)出敏感的態(tài)勢, 另一個則是完全沒有任何反應(yīng)。在團隊當(dāng)中, 有人對化合物是否存在問題產(chǎn)生了懷疑, 老張卻沉著冷靜地調(diào)出了這兩株細胞的基因突變方面的檔案。
一經(jīng)比對就察覺: 敏感的那一棵所攜帶的乃是KRAS G12D突變, 耐藥的那一棵為KRAS G12C突變。盡管都屬于KRAS突變, 然而不同的突變位點針對于藥物的結(jié)合能力差異極大。此案例隨后轉(zhuǎn)變成了他們公司設(shè)于內(nèi)部展開培訓(xùn)的教材——在挑選腫瘤細胞株之際, 絕非僅僅盯著“是何種癌癥”加以判斷, 更得瞧一瞧“確切是怎樣的突變”。
當(dāng)下老張?zhí)暨x那種細胞株之時, 必定會率先問明白, 這一款細胞的突變譜狀況如何, 藥物抗性標(biāo)記是怎樣的, 還有此細胞是否曾被用于文獻里去評估類似機制的藥物。倘若賣家無法給出確切回答, 那么這老張寧愿多耗費錢財去購買具備完整背景資料的細胞株, 也不愿意就這份有風(fēng)險的情況去冒險。
腫瘤細胞株的購買渠道哪家更靠譜？
老張在踩坑之后, 花費啦好多時間去整理靠譜噠購買渠道, 他歸納出了幾條經(jīng)驗, 其一, 要優(yōu)先挑選有著ATCC或者類似權(quán)威認證授權(quán)噠代理商, 這些機構(gòu)針對細胞株噠驗證流程尤為嚴格, 每一個批次都有著詳盡噠質(zhì)檢報告, 其二, 要避開那些“打包便宜售賣”噠賣家, 腫瘤細胞株可不是白菜, 價格太過低往往就意味著來源充滿可疑之處, 其三, 購買之前能夠先要一份試養(yǎng)包, 瞅瞅細胞在你實驗室噠條件之下能不能存活。
有一回, 老張經(jīng)由一個全新渠道購得一株細胞, 那一方宣稱“現(xiàn)貨充裕、價格實惠”。還好老張預(yù)先提出試養(yǎng)請求, 結(jié)果快遞送達的細胞于運輸進程中便大量死去, 復(fù)蘇之后活性匱乏百分之七十。他暗自慶幸自己未曾徑直下單大批購入, 不然又是一筆冤屈錢財。
腫瘤細胞株的鑒定周期一般多久？
后來老張跟我講, 他有一件最后悔的事, 那就是當(dāng)初在鑒定時間方面沒有預(yù)先做好規(guī)劃。STR鑒定雖說從技術(shù)層面來講并非復(fù)雜, 然而從送去樣本到拿到報告, 一般來講需要一至兩周的時間。要是碰到節(jié)假日或者檢測機構(gòu)排期處于緊張狀態(tài), 等上一個月那也并不罕見。
他當(dāng)下采取的做法是, 每當(dāng)有一批新的細胞到手之后, 便馬上提取其中一部分的DNA送去進行STR鑒定, 與此同時將剩余的細胞予以凍存處理。等到鑒定報告出來并且確認沒有錯誤之后, 才會正式開啟實驗。這般做雖然在前期的時候速度會慢一些, 然而在后面的時候不會因為細胞身份方面的問題致使整個項目需要返工。
腫瘤細胞株的培養(yǎng)條件有哪些要求？
不同的腫瘤細胞株, 對于培養(yǎng)條件的要求, 存在著極大的差異。老張先前養(yǎng)的一株乳腺癌細胞, 在標(biāo)準的DMEM培養(yǎng)基里, 生長狀況頗為良好, 然而, 當(dāng)換成另一株卵巢癌細胞后, 同樣的培養(yǎng)基卻致使細胞狀態(tài)直線下滑。他查閱相關(guān)資料之后發(fā)現(xiàn), 那株卵巢癌細胞, 對谷氨酰胺的消耗速度極快, 必須每日補加, 方可維持正常的增殖。
不僅存在溫度方面的需求, 還有pH值方面的需求, 以及貼壁因子的需求, 而且每個細胞株都有著屬于自身的“脾氣”。老張如今每當(dāng)拿到一株新細胞時, 首要做的事情便是查看賣家所提供的培養(yǎng)指南, 進而按照其中推薦的條件嚴格地操作, 絕對不會憑借經(jīng)驗去進行“猜測”。他以開玩笑的方式說道: “細胞比我老婆還要難以伺候, 然而要是伺候得好了, 它們就會給你良好的數(shù)據(jù)?！薄?/p>
腫瘤細胞株的研究進展有哪些新方向？
前段時間, 我跟老張一塊吃飯, 他滿懷興致地談到了行業(yè)內(nèi)的新趨勢。當(dāng)下, 腫瘤細胞株的研究, 并非僅停留在“養(yǎng)活便罷”的層面, 而是朝著精準化以及個性化的方向邁進。舉例來說, 類器官培養(yǎng), 基因編輯細胞株的構(gòu)建, 以及借助 CRISPR 技術(shù)敲入熒光標(biāo)記的細胞系, 這些均可使腫瘤研究更趨近于體內(nèi)的真實情形。
老張身處的那家公司, 近來也著手開展人源化腫瘤細胞株庫的布局工作, 將取自患者樣本里分離出來的腫瘤細胞, 實施有限傳代之后予以凍存, 進而用于藥物篩選。盡管他認可這條路投入相當(dāng)巨大, 然而他堅信, 在未來的這五到十年期間, 哪一方能夠掌握更多具備高質(zhì)量的腫瘤細胞株資源, 那一方便能夠在腫瘤藥物研發(fā)進程里占據(jù)領(lǐng)先的地位。
腫瘤細胞株的存儲方法有哪些？
老張如今對于細胞存儲這一事情特別用心, 他往昔認為凍存細胞不就是隨便找個程序降溫盒, 然后丟進液氮罐就可以了嗎, 直至有一回, 實驗室出現(xiàn)斷電情況, 液氮罐報警器未發(fā)出聲響, 一罐子珍貴的細胞全都失去活性, 他這才察覺到存儲環(huán)節(jié)是多么重要。
他如今所采用的辦法是, 針對每個細胞株, 要進行凍存, 至少凍存五個支, 將其分別放置于兩個不一樣的液氮罐之中, 并且每個罐子都配備有獨立的溫度監(jiān)控以及報警系統(tǒng)。其凍存液所使用的乃是含有百分之十DMSO的完全培養(yǎng)基, 經(jīng)過程序降溫之后, 要快速轉(zhuǎn)入液氮。每次復(fù)蘇一支之后, 要是確認并無問題, 便會馬上再次進行補凍一支, 從而確保庫存不會發(fā)生減少。
他還養(yǎng)成了這么一個習(xí)慣, 每三個月就針對液氮罐開展一回液位檢查, 并且用記錄本予以登記, 這些看起來繁雜無比的流程, 在關(guān)鍵的時刻是能夠挽救性命的。
腫瘤細胞株的價格為什么差異這么大？
老張在踩坑以后曾專門針對這個問題展開調(diào)查, 他發(fā)覺, 同樣屬于肺癌細胞株范疇, 其價格存在從幾百元到上萬元區(qū)間不等的情況, 價格較為便宜的細胞株往往是傳代次數(shù)眾多、來源缺乏透明度且沒有完整鑒定數(shù)據(jù)的, 而價格較貴的細胞株通常是原始來源清晰、歷經(jīng)嚴格驗證并且附帶STR和支原體檢測報告的。
另外存在一個因素稱作“稀有度”, 舉例來說, 帶有特定耐藥突變的細胞株, 或者從罕見腫瘤組織里分離出來的原代細胞株, 其價格自然而然會更高一些。老張當(dāng)下所持的觀點是: 購買細胞株跟購買保險的情況是相類似的, 便宜的不見得就存在虧損狀況, 然而價格貴的一般而言是不會坑騙你的。
腫瘤細胞株的鑒定方法有哪幾種？
后來, 老張成為了他們公司內(nèi)部的“細胞鑒定專家”, 他跟我講, 當(dāng)前最常運用的鑒定辦法是STR分析, 借助檢測細胞DNA里短串聯(lián)重復(fù)序列的片段長度去確認細胞身份, 準確率相當(dāng)高, 除此之外還有同工酶分析、核型分析以及支原體PCR檢測。
他著重地特別強調(diào)這個: 不要僅僅只是看一份鑒定報告然后就去覺得所有事情都已經(jīng)萬事大吉沒有問題了。細胞在進行傳代的這個過程當(dāng)中隨時都有可能會發(fā)生變化, 最為理想化的一種做法是每當(dāng)開啟新的細胞批次的時候都要去做一次鑒定, 至少也得要保證每三個月進行一次抽查檢驗。老張所在的公司現(xiàn)在已經(jīng)把這個內(nèi)容寫進了質(zhì)量管理體系里面, 所有的細胞株都已經(jīng)建立了一種類似“身份證檔案”的東西, 每當(dāng)每次實驗結(jié)果出現(xiàn)異常的時候, 最先要做的第一件事情就是去復(fù)查細胞的身份。
腫瘤細胞株的來源有哪些分類？
老張在最后跟我講, 他于這些年里最大的收獲之處, 便是學(xué)會了去看細胞株所稱的“出身”。腫瘤細胞株依照來源能夠劃分成商業(yè)細胞株, 科研機構(gòu)交換細胞株以及實驗室自建細胞株。商業(yè)細胞株一般情況下質(zhì)量最為穩(wěn)定, 然而價格卻是最高的；科研機構(gòu)交換得來的那得看對方實驗室的管理水平怎樣, 有時候能夠獲取到極為稀有的株系, 不過風(fēng)險同樣很大；自建細胞株是最貼近原始組織特征的, 只是構(gòu)建以及驗證周期比較長。
僅針對關(guān)鍵實驗, 他所采用的選擇標(biāo)準是, 只用擁有完整背景資料的商業(yè)細胞株；僅用于探索性研究時, 他會嘗試從合作單位那兒獲取一些具備特色的細胞株, 不過必定會先去做全面驗證。正是這樣的策略, 幫助他們公司避開避免了好幾次實驗事故, 這也使得他從一個老是踩坑的人搖身一變, 成了團隊當(dāng)中的技術(shù)把關(guān)人。
