不久前的那兩天, 老張忽然于微信之上尋覓我, 其語氣之中攜著一股興奮狀, 言道: “兄弟, 我終于是找尋到一款靠得住的甲基化特異性‘PCR試劑盒’了, 此次用于實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)美妙得不得了！”。
對我而言能持續(xù)五年保持相識關(guān)系的朋友老張, 于南方占據(jù)一個(gè)生物技術(shù)研發(fā)范疇主管職位, 所在公司主方向聚集于腫瘤早期篩查這一領(lǐng)域, 近兩年里在這個(gè)業(yè)內(nèi)空間, 存在一個(gè)名為“甲基化”的概念呈現(xiàn)出極為火爆的態(tài)勢, 老張所在公司的老板, 已然將關(guān)注焦點(diǎn)鎖定在了這一領(lǐng)域, 老張自去年下半年伊始, 就全身心投入到了甲基化特異性PCR試劑盒篩選這一項(xiàng)工作當(dāng)中。
就是講實(shí)話, 老張所做的這個(gè)活兒是比較難開展的。甲基化檢測在聽起來的時(shí)候顯得高端大氣上檔次, 然而在實(shí)際真正落實(shí)到具體操作之時(shí), 所出現(xiàn)的問題比預(yù)先設(shè)想的要多出許多。他們所在的公司先前使用過幾款在市面上較為常見的試劑盒, 不是在靈敏度方面存在較大差距, 達(dá)不到應(yīng)有的標(biāo)準(zhǔn), 就是在特異性這個(gè)方面出現(xiàn)失誤——明明是屬于正常的樣本, 卻偏偏檢測出陽性信號, 這種情況致使整個(gè)團(tuán)隊(duì)有那么一段時(shí)間陷入自我懷疑, 對自身能力產(chǎn)生極大的質(zhì)疑。
甲基化特異性PCR試劑盒，到底難在哪？
在去年十月的一個(gè)晚上, 老張頭一回跟我發(fā)表不滿言論, 當(dāng)時(shí)他才從實(shí)驗(yàn)室出來, 臉上耷拉著倆大黑眼圈, 說道 “你講講這甲基化特異性PCR試劑盒, 從原理方面講不就是個(gè)經(jīng)過改良后的PCR, 可是為啥在實(shí)際操作期間, 各種各樣意想不到的麻煩事兒接二連三地冒出來? ”。
我向他詢問究竟是怎樣的具體問題, 他開始掰著手指頭進(jìn)行細(xì)數(shù), 其一, 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率呈現(xiàn)不穩(wěn)定的狀況, 在一些批次的DNA完成轉(zhuǎn)化之后, 甲基化位點(diǎn)存在保護(hù)不全的情況, 所擴(kuò)增出來的產(chǎn)物雜亂無章, 其二, 引物設(shè)計(jì)在表面上看似十分完美, 然而實(shí)際跑出來的熔解曲線卻總是會(huì)出現(xiàn)非特異性峰；其三, 最為令人頭疼的是, 批次之間的重復(fù)性欠佳, 同一批樣本轉(zhuǎn)換試劑盒之后結(jié)果就無法相互對應(yīng)。
做甲基化檢測的人, 很有可能都碰到過這些問題。甲基化特異性PCR試劑盒的關(guān)鍵核心, 仰仗重亞硫酸鹽對待變處理, 使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為尿嘧啶, 緊接著運(yùn)用專門設(shè)計(jì)的引物, 用以辨別區(qū)分甲基化以及未甲基化的序列。聽聞感覺容易, 但每一環(huán)節(jié)都對試劑盒的穩(wěn)定性以及優(yōu)化程度進(jìn)行考核檢驗(yàn)。老張所在的公司設(shè)在深圳, 于那段時(shí)期, 他差不多將周邊所有供應(yīng)商的樣品都嘗試了一遍, 然而最終沒有一個(gè)能讓他產(chǎn)生十足滿意之感的。
從源頭解決問題：關(guān)鍵參數(shù)怎么盯？
轉(zhuǎn)折出現(xiàn)于今年一月, 老張參與完在上海舉辦的一個(gè)行業(yè)交流會(huì)后歸來, 他整個(gè)人的狀態(tài)顯著不同了, 他一踏入家門便說道: “我此次見到了幾位從事甲基化檢測的行家, 他們?yōu)槲抑该髁艘粭l路途——?jiǎng)e僅僅關(guān)注試劑盒的品牌, 而要看核心參數(shù)?！?。
他掏出手機(jī)翻頁給我看, 我問他什么參數(shù), 他說: “第一個(gè), 轉(zhuǎn)化效率必須要大于等于百分之九十九點(diǎn)五, 要是低于這個(gè)數(shù), 后面所有數(shù)據(jù)都毫無意義。第二個(gè), 要看試劑盒對于低起始量DNA的適應(yīng)情況, 我們大量的臨床樣本只有幾十納克, 有些試劑盒規(guī)定從一百納克開始, 那完全不具備實(shí)用性。第三個(gè), 要看它有沒有內(nèi)部質(zhì)控體系, 像是帶有一個(gè)人工甲基化對照, 如此每次跑板你都能清楚轉(zhuǎn)化這一步是否出現(xiàn)問題?！薄?/p>
是老張, 他依照這個(gè)思路又重新進(jìn)行了一遍篩選工作, 此后他前往蘇州一帶那兒一家主要專做分子診斷原料這方面的公司, 在那兒取得了他們家最新的甲基化特定性PCR試劑盒這一樣的器件。而這一回他并不像之前那次那樣匆匆 rush 著去開展大樣本的操作工作, 反而是先著手做了三件事, 其一是運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品來驗(yàn)證靈敏度, 其二是采用正常血細(xì)胞DNA去驗(yàn)證特異性，其三是再拿取一批有著已知結(jié)果的腫瘤組織樣本開展相關(guān)的盲測工作。
有個(gè)結(jié)果, 使得老張略微感到有點(diǎn)意外, 在50納克DNA起始量的這種條件當(dāng)下, 一款試劑盒的轉(zhuǎn)化效率很穩(wěn)定地處于99.8%以上, 最讓他心服口服的在于其特異性, 運(yùn)行過一百多個(gè)正常樣本, 不存在任何一個(gè)假陽性情況, 老張跟我講稱, 以前所使用的那幾款, 總會(huì)有幾個(gè)樣本出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象, 致使他每次看到陽性信號時(shí)都得進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證, 而這一款則很好, 結(jié)果清晰干脆。
團(tuán)隊(duì)協(xié)作：從單打獨(dú)斗到標(biāo)準(zhǔn)化流程
老張團(tuán)隊(duì)因有了趁手工具, 工作效率開始飆升, 然而試劑盒僅是第一步, 真正的挑戰(zhàn)在于要將檢測流程予以標(biāo)準(zhǔn)化。甲基化特異性PCR這項(xiàng)技術(shù), 對操作細(xì)節(jié)極為敏感, 其中包括DNA提取質(zhì)量、重亞硫酸鹽處理時(shí)間、PCR循環(huán)參數(shù), 隨便哪一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)些許紕漏, 結(jié)果便會(huì)出現(xiàn)偏差。
三月初時(shí), 老張將團(tuán)隊(duì)召集在一起, 舉行了一場會(huì)議。此前的他, 向來習(xí)慣于獨(dú)自默默無聞地埋頭苦干 , 這次他變得機(jī)靈聰慧起來 , 把曾經(jīng)積累的經(jīng)驗(yàn)予以分享。他要求每一位實(shí)驗(yàn)員, 使用同一型號的甲基化特異性PCR試劑盒 , 針對同一批樣本展開操作 , 而后對結(jié)果實(shí)施比較核對。在首次進(jìn)行比對時(shí) , 竟出現(xiàn)了一種狀況 , 有三個(gè)人所測出來的Ct值 , 相互之間相差了近乎兩個(gè)循環(huán)。那么 , 問題究竟出在何處呢? 經(jīng)過細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)刂匦聦彶榉治?, 發(fā)現(xiàn)存在這樣的情況 , 有的人在進(jìn)行重亞硫酸鹽處理期間 , 沒有做到嚴(yán)格地避免光線照射 , 有的人所使用的PCR儀 ，其溫度校準(zhǔn)出現(xiàn)了差錯(cuò)。
老張干脆弄了一套標(biāo)準(zhǔn)的操作流程, 每一步都定死了, 從DNA提取之后濃度的最低要求開始, 到轉(zhuǎn)化試劑的使用時(shí)長, 再到PCR擴(kuò)增的時(shí)候退火溫度梯度。他還和試劑盒的廠家技術(shù)團(tuán)隊(duì)建了群, 碰到問題隨時(shí)進(jìn)行遠(yuǎn)程會(huì)診。這套流程運(yùn)行了一個(gè)月以后, 團(tuán)隊(duì)內(nèi)部的重復(fù)性誤差降低到了0.5個(gè)循環(huán)以內(nèi)。老張講: “以前以為甲基化檢測是比較玄乎的東西, 現(xiàn)在發(fā)覺它實(shí)際上就是一門科學(xué), 只要正確使用試劑盒、做好流程管控, 結(jié)果就是穩(wěn)定的。”。
實(shí)戰(zhàn)檢驗(yàn)：從實(shí)驗(yàn)室到真實(shí)樣本
是今年四月的一回實(shí)戰(zhàn), 真正使得老張對這款甲基化特異性PCR試劑盒篤定不移, 他們公司與廣州某機(jī)構(gòu)協(xié)作, 收取了一批肺癌高危人群的痰液樣本, 而去開展甲基化標(biāo)志物的篩查, 這批樣本數(shù)量不多, 然而情形繁雜, 有的樣本DNA濃度特別低, 有的樣本保存時(shí)長超過兩年, DNA降解得相當(dāng)嚴(yán)重。
老張心里實(shí)際上沒什么底, 他拿出先前用過的兩款試劑盒拿來做對比, 其結(jié)果很殘酷呀: 其中一款在低濃度樣本當(dāng)中直接擴(kuò)增不出來, 另外一款雖然在低濃度狀況下能夠出結(jié)果, 然而陽性樣本和陰性樣本的區(qū)分度僅有1.5個(gè)Ct值, 根本沒辦法做出判斷。而他當(dāng)下正在使用的這款甲基化特異性PCR試劑盒, 即便在10納克以下的DNA起始量這種情況下, 依舊能夠穩(wěn)定地區(qū)分甲基化與未甲基化的信號, 陽性樣本和陰性樣本的Ct值差異在4個(gè)循環(huán)以上。
那天晚上, 老張給我打電話，其聲音之中帶著那種久違了的輕松, 他說道: “兄弟, 我終于能夠跟老板把任務(wù)給定好了。這批樣本完成跑完之后, 其陽性檢出率與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比, 一致性是超過了95%的。并且整個(gè)流程, 從樣本處理開始一直到出結(jié)果, 僅僅只用了六個(gè)小時(shí)。”。
回頭再看：選對工具能省多少心？
老張現(xiàn)今所處的狀態(tài), 與半年之前呈現(xiàn)出巨大反差。往昔的時(shí)候, 他每日都沉浸于實(shí)驗(yàn)室之中忙于解決突發(fā)狀況, 而如今他擁有了更為充沛的時(shí)間去深入思考全新的項(xiàng)目。上周, 我前往他所在的公司找尋他, 目睹他正與團(tuán)隊(duì)展開探討, 思索著怎樣將甲基化檢測與NGS相互結(jié)合從而開展多靶點(diǎn)的篩查工作。他言道: “核心的問題已然得到解決, 后續(xù)的皆是額外增加的部分。”。
我詢問他, 要是給那些做甲基化檢測的其他同仁一條建議, 他會(huì)講些什么, 老張思索了一番, 鄭重地說道, 別在挑選試劑盒這事上節(jié)省費(fèi)用, 甲基化特異性PCR試劑盒乃是你所有數(shù)據(jù)的基礎(chǔ), 一個(gè)性能平穩(wěn)的試劑盒, 能夠幫你省下起碼一半的重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間, 然而怎樣判定是否穩(wěn)定呢, 你得親自去動(dòng)手測量, 別僅僅看宣傳頁所示內(nèi)容, 拿你們的真實(shí)樣本, 跑三批數(shù)據(jù), 瞧瞧批次之間的CV值, 瞅瞅特異性, 心里就會(huì)有底了。
他緊接著補(bǔ)充道, “另外還有一點(diǎn), 千萬別把技術(shù)支撐給忽視掉。那些優(yōu)秀的廠家是會(huì)幫你去解決應(yīng)用端方面的問題的, 就好比我所使用的那款試劑盒, 他們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)甚至于幫我們修整優(yōu)化了一版引物設(shè)計(jì), 使得擴(kuò)增效率提高了差不多10%?！?。
老張的故事講完了。從去年秋天的焦頭爛額，到今年夏天的游刃有余，他走過了一條很多做甲基化檢測的人都會(huì)走的路。甲基化特異性PCR試劑盒這個(gè)賽道，玩家越來越多，產(chǎn)品魚龍混雜。真正能幫到你的，不是哪個(gè)牌子最響，而是哪個(gè)產(chǎn)品能在你的實(shí)驗(yàn)體系里穩(wěn)定輸出可靠數(shù)據(jù)。
倘若此刻你同樣正為甲基化檢測所具備的重復(fù)性以及靈敏度而發(fā)愁, 那就不妨如同老張那般, 自最根基的參數(shù)著手, 去尋覓一款能夠經(jīng)受住自身驗(yàn)證的試劑盒。畢竟, 當(dāng)實(shí)驗(yàn)已然無法推進(jìn)下去之際, 更換一種工具通常相比更換一種思路而言會(huì)更具成效。
