實(shí)驗(yàn)原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測1,25二羥基維生素D3DHVD3。預(yù)先包被DHVD3特異性捕獲抗體的微孔板與樣本中的DHVD3結(jié)合，再加入生物素標(biāo)記的檢測抗體形成夾心復(fù)合物，最后通過辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素催化TMB顯色，顏色深淺與樣本中DHVD3濃度成正比。
結(jié)果的計(jì)算：
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（作圖時(shí)去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)及參考曲線：
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
| 校準(zhǔn)品濃度(pg/mL) | 500.00 | 250.00 | 125.00 | 62.50 | 31.25 | 15.63 | 7.81 | 0.00 |
| OD450/630值 | 2.716 | 1.551 | 0.800 | 0.486 | 0.377 | 0.175 | 0.090 | 0.043 |
| 校正OD值 | 2.673 | 1.508 | 0.757 | 0.443 | 0.334 | 0.132 | 0.047 | 0.000 |
本圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果
靈敏度：
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為7.8125pg/mL
特異性：
可檢測樣本中的 D3DHVD3，且與其它類似物無明顯交叉反應(yīng)
檢測范圍：
本試劑盒的檢測范圍為15.625pg/mL-500pg/mL
樣本檢測：
血清，血漿，細(xì)胞培養(yǎng)上清及其他生物學(xué)樣本
樣本處理：
1. 血清樣本
室溫靜置2小時(shí)或4℃過夜后，1000×g離心20分鐘
取上清，-20℃或-80℃保存（避免反復(fù)凍融）
2. 血漿樣本
用EDTA或肝素抗凝，采集后30分鐘內(nèi)2-8℃ 1000×g離心15分鐘
取上清，保存條件同血清
3. 組織勻漿
用預(yù)冷PBS沖洗組織，按1:9重量體積比加入PBS（含蛋白酶抑制劑）
冰上勻漿后離心取上清
4. 細(xì)胞裂解液
推薦使用非變性裂解緩沖液（避免化學(xué)裂解液干擾）
檢測實(shí)驗(yàn)的局限性：
本試劑盒僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。
1. 試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
2. 如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、實(shí)驗(yàn)員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)果變化。
3. 樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。
4. 本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)：
1. 混合蛋白質(zhì)溶液時(shí)，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨(dú)使用容器。
2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。
3. 當(dāng)使用自動洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
4. 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{(lán)色。
5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。
6. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
7. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
8. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
9. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
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資料/datasheet
