作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工具的ELISA試劑盒，在蛋白定量檢測(cè)里應(yīng)用廣泛。對(duì)獲取可靠數(shù)據(jù)而言，理解其原理以及操作要點(diǎn)至關(guān)重要。本文從實(shí)際使用這一角度出發(fā)，分享試劑盒選擇還有操作的核心思路。
如何選擇合適靈敏度的試劑盒
試劑盒所能檢測(cè)到的最低目標(biāo)物濃度，被稱作靈敏度。先去查閱文獻(xiàn)，或者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以此來(lái)確定樣本里目標(biāo)蛋白的大致范圍，之后再挑選檢測(cè)范圍覆蓋這個(gè)區(qū)間的產(chǎn)品。靈敏度可不是越高就越好，過(guò)高的靈敏度有可能帶來(lái)非特異性信號(hào)，進(jìn)而干擾結(jié)果判斷。
對(duì)于不同廠家所生產(chǎn)的試劑盒，其靈敏度標(biāo)注方式是存在著差異的，在此建議去對(duì)比說(shuō)明書當(dāng)中的最低檢測(cè)限數(shù)據(jù)。要是該樣本的濃度處于未知狀態(tài)，則可以優(yōu)先去選擇寬檢測(cè)范圍的產(chǎn)品，并且要預(yù)留出稀釋空間。
怎樣判斷試劑盒的特異性表現(xiàn)
區(qū)分目標(biāo)蛋白跟類似結(jié)構(gòu)的能力，由特異性反映試劑盒來(lái)體現(xiàn)。交叉反應(yīng)會(huì)致使假陽(yáng)性出現(xiàn)，特別是在檢測(cè)同源性較高的蛋白家族之際。查看說(shuō)明書里的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)，確認(rèn)跟相關(guān)蛋白的干擾值處在低于0.5%的狀況。
展開(kāi)實(shí)際驗(yàn)證操作之際，能夠選擇運(yùn)用空白基質(zhì)加標(biāo)樣本去開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)，以此來(lái)觀察背景信號(hào)的強(qiáng)度情況。針對(duì)于像細(xì)胞裂解液或者血清替代品這類復(fù)雜樣本來(lái)講，建議同步設(shè)置陰性對(duì)照，借助其幫助去識(shí)別非特異性結(jié)合的來(lái)源之處。
試劑盒操作穩(wěn)定性如何保障
操作的穩(wěn)定性是由試劑保存的條件以及操作流程的一致性所決定，拆封后沒(méi)有使用完的那些組合物要按照相應(yīng)要求進(jìn)行分裝并且凍存起來(lái)，以此來(lái)避免反復(fù)進(jìn)行凍融現(xiàn)象。洗板的步驟必須要對(duì)浸泡時(shí)間以及洗滌的次數(shù)加以控制，要是過(guò)多洗滌就會(huì)使信號(hào)得到降低，而要是過(guò)少洗滌則會(huì)有背景殘留。
使用多道移液器來(lái)進(jìn)行加樣的這個(gè)過(guò)程當(dāng)中，要留意槍頭的貼合程度，每一個(gè)步驟所要進(jìn)行的孵育溫度必須恒定在37℃。建議每一次開(kāi)展實(shí)驗(yàn)的時(shí)候都繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且加入質(zhì)控品以此對(duì)板間出現(xiàn)的差異進(jìn)行監(jiān)控。記錄每一塊板的顯色時(shí)間，嚴(yán)格做到統(tǒng)一讀數(shù)窗口。
樣本處理有哪些常見(jiàn)注意事項(xiàng)
會(huì)影響抗原抗體結(jié)合的是樣本基質(zhì)里的干擾物質(zhì)，高脂的樣本或者是高粘度樣本需用離心的方式來(lái)獲取其中的上清，在有必要的時(shí)候以使用稀釋液做相應(yīng)的倍數(shù)稀釋，溶血樣本所釋放出來(lái)的那種血紅蛋白存在著可能抑制酶活性的情況，所以應(yīng)當(dāng)避免去使用。
對(duì)處理之前用于評(píng)估的樣本保存時(shí)間予以考量，針對(duì)長(zhǎng)久凍存的樣本來(lái)講建議采取小量分裝之舉措；稀釋的倍數(shù)需要借助預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)加以確定，以此讓檢測(cè)所浮現(xiàn)的值能夠處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間那段范圍，放入樣本過(guò)后要輕巧地拍打那板架從而實(shí)現(xiàn)混勻效果，以此躲過(guò)產(chǎn)生氣泡的情況。
您于實(shí)際運(yùn)用 ELISA 試劑盒之際，最為經(jīng)常碰到的操作方面的問(wèn)題，究竟是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合并非那么理想呢，還是樣本重復(fù)性比較差呢？歡迎來(lái)分享您所擁有的經(jīng)驗(yàn)。
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