首次培養(yǎng)的細(xì)胞，是指直接從活體組織取出后的原代細(xì)胞，它們最大程度保持了來(lái)源組織的生物學(xué)特性以及遺傳信息。在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究這兒，原代細(xì)胞是模擬體內(nèi)生理狀態(tài)的理想模型，其應(yīng)用涵蓋了藥物篩選、病毒學(xué)研究等好多不同方向。
原代細(xì)胞分離技巧
要獲取高質(zhì)量的原代細(xì)胞關(guān)鍵環(huán)節(jié)涵蓋組織處理以及酶消化法的挑選，不同組織類(lèi)型所適用的酶組合具有顯著不同，比如說(shuō)肝組織通常使用膠原酶，然而神經(jīng)組織卻需要更為溫和的胰蛋白酶，操作期間要把組織剪成 1 至 3 立方毫米的小塊，于 37 度的條件下進(jìn)行 30 至 60 分鐘的消化工作，在這期間每隔 10 分鐘要輕輕搖晃一回。
細(xì)胞懸液經(jīng)消化后，要通過(guò)100微米細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾，以此去除未消化的組織碎片，接著用紅細(xì)胞裂解液處理，這樣能夠有效排除血細(xì)胞干擾，整個(gè)分離過(guò)程需控制在2小時(shí)內(nèi)完成，因?yàn)闀r(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)顯著降低細(xì)胞活率，新手建議從脾臟或腎臟等結(jié)締組織較少的器官開(kāi)始練習(xí)。
原代細(xì)胞培養(yǎng)難點(diǎn)
原代細(xì)胞對(duì)于環(huán)境方面的變化是極其敏感的，培養(yǎng)基的構(gòu)成成分、pH的值、滲透壓的微小起伏變動(dòng)都有可能致使生長(zhǎng)呈現(xiàn)停滯狀態(tài)，血清的濃度一般情況下是需要比細(xì)胞系高出百分之五至百分之十的程度，并且不同批次的血清是需要預(yù)先進(jìn)行測(cè)試的，培養(yǎng)箱的濕度是必須維持在95%以上的數(shù)值，以此來(lái)避免因液體蒸發(fā)而引發(fā)的滲透壓升高。
還有一個(gè)常常出現(xiàn)的問(wèn)題是，成纖維細(xì)胞過(guò)度地增殖致使目的細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，解決的辦法涵蓋差速貼壁法，通過(guò)利用成纖維細(xì)胞貼壁更為快速的特性來(lái)實(shí)施分離，或者朝著培養(yǎng)基里添加適量的L - 亮氨酸甲酯，以此選擇性地清除成纖維細(xì)胞，要定期去觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦出現(xiàn)空泡或者顆粒增多的情況，就應(yīng)當(dāng)馬上調(diào)整培養(yǎng)條件。
原代細(xì)胞傳代注意事項(xiàng)
和原代細(xì)胞相較，傳代次數(shù)被嚴(yán)格限制，一般僅僅能夠穩(wěn)定傳三到五代。每一次傳代之前都得確認(rèn)細(xì)胞融合度處在百分之八十至百分之九十，傳代過(guò)晚會(huì)加快老化。胰酶消化的時(shí)間需要精準(zhǔn)把控，以細(xì)胞變圓然而并未脫落作為最佳狀態(tài)，過(guò)量消化會(huì)對(duì)膜蛋白造成損傷。
傳代的比例通常不會(huì)超出一比二，然而高密度進(jìn)行培養(yǎng)反倒有益于維持細(xì)胞的功能。建議于傳代之后第一天添加諸如維生素C之類(lèi)的抗氧化劑，以此幫助細(xì)胞去抵抗氧化應(yīng)激。每一次做傳代都需要記錄代數(shù)編號(hào)，當(dāng)超過(guò)五代之后細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出梭形化的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)堅(jiān)決地丟棄并重新進(jìn)行制備。
原代細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
進(jìn)行原代細(xì)胞凍存操作時(shí)，要采用那種含有高濃度血清以及10%二甲基亞砜的凍存液，并且要運(yùn)用程序降溫盒，按照每分鐘下降1度這樣的速率，將其冷卻到零下80度。要是直接把它投入液氮的話，會(huì)因?yàn)楸纬芍率辜?xì)胞膜破裂。每一支凍存管里面的細(xì)胞量必須達(dá)到1×10的6次方以上，才能夠確保復(fù)蘇之后的存活數(shù)量。
展開(kāi)復(fù)蘇操作之時(shí)務(wù)必要做到快速，把凍存管安置到處于37度溫度的水浴鍋當(dāng)中開(kāi)展震蕩以此實(shí)現(xiàn)解凍，要于1分鐘之內(nèi)達(dá)成融化的狀態(tài)，解凍完成之后要馬上運(yùn)用預(yù)熱的培養(yǎng)基去稀釋二甲基亞砜，以低速的方式進(jìn)行離心以此去除殘留，復(fù)蘇過(guò)后的細(xì)胞需要最少經(jīng)24小時(shí)才能恢復(fù)到貼壁的狀態(tài)，在這期間不要過(guò)于頻繁地去進(jìn)行觀察或者移動(dòng)培養(yǎng)瓶，要是活率低于60%，建議重新進(jìn)行制備而不要勉強(qiáng)去使用。
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