PCR擴(kuò)增試劑盒的核心指標(biāo)有哪些
去評(píng)價(jià)一款用于PCR擴(kuò)增的試劑盒，主要得看三個(gè)指標(biāo)，這三個(gè)指標(biāo)分別是擴(kuò)增效率，靈敏度以及特異性。擴(kuò)增效率對(duì)目標(biāo)序列能不能被有效放大起著決定性作用，一般情況下要求處于90%至110%這個(gè)范圍之間。靈敏度體現(xiàn)出試劑盒檢測(cè)低濃度模板的能力，而特異性則用來(lái)保證只擴(kuò)增目標(biāo)片段，從而避免出現(xiàn)非特異性條帶。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行選購(gòu)的時(shí)候，應(yīng)該優(yōu)先去查看放置在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)里的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，特別是批間差以及穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。
如何根據(jù)樣本類(lèi)型選擇試劑盒
不同樣本基質(zhì)針對(duì)PCR反應(yīng)的抑制程度不一樣，有著極大差異。血液、土壤、植物組織等常常含有酚類(lèi)、多糖或者腐殖酸，這些物質(zhì)能夠抑制Taq酶活性。針對(duì)復(fù)雜樣本，應(yīng)當(dāng)選擇含有強(qiáng)效抑制物耐受組分的試劑盒，像配備特殊配方緩沖液的試劑盒，或者熱啟動(dòng)酶試劑盒。對(duì)于純化后的DNA樣本或者cDNA樣本，就可以采用標(biāo)準(zhǔn)型試劑盒，其成本更低，而且擴(kuò)增速度更快。
擴(kuò)增曲線異常怎么排查原因
擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)鋸齒狀形態(tài)、平臺(tái)期位置過(guò)低或者起峰時(shí)間過(guò)晚，一般情況下這表明試劑盒保存的方式不正確或者反應(yīng)體系配制存在錯(cuò)誤。首先要去檢查試劑是不是反復(fù)凍融已經(jīng)超過(guò)了5次，若如此酶活性會(huì)顯著下降。其次要確認(rèn)熒光染料或者探針是不是在避光的條件下保存，因?yàn)楣庹諘?huì)致使熒光發(fā)生淬滅。最后要再次核對(duì)模板濃度，過(guò)高的模板會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制，而過(guò)低的模板又有可能造成隨機(jī)起峰。
怎樣判斷試劑盒的批次穩(wěn)定性
相同一款的PCR擴(kuò)增試劑盒，不同的批次中間，應(yīng)當(dāng)保持一致的性能。實(shí)驗(yàn)室能夠建立內(nèi)部的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，采用相同的一份弱陽(yáng)性模板，持續(xù)測(cè)試三個(gè)批次，對(duì)比Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差。要是標(biāo)準(zhǔn)差小于0.5個(gè)循環(huán)，那就表明批次之間的穩(wěn)定性良好。與此同時(shí)，記錄不同批次的擴(kuò)增曲線形態(tài)，以及終點(diǎn)熒光強(qiáng)度，這些數(shù)據(jù)能夠幫助快速地識(shí)別試劑盒的質(zhì)量波動(dòng)。
可可.jpg)
