用來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的試劑盒，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里常用的工具，它借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)達(dá)成DNA片段的快速擴(kuò)增。我對(duì)于這類試劑盒的基本認(rèn)知是，它的核心主要在于提供穩(wěn)定又高效的酶體系，還有優(yōu)化后的緩沖液以及精確無(wú)誤的反應(yīng)組分，而這些直接決定了擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)到底能不能成功。下面依據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，來(lái)談?wù)勌暨x以及使用過(guò)程當(dāng)中的關(guān)鍵點(diǎn)。
PCR試劑盒怎么選
選擇PCR試劑盒，首先得看酶的熱啟動(dòng)性能，熱啟動(dòng)Taq酶能夠有效地避免進(jìn)行非特異性擴(kuò)增，特別是在復(fù)雜模板當(dāng)中表現(xiàn)得十分突出，比如在做基因組DNA擴(kuò)增的時(shí)候，普通酶容易產(chǎn)生彌散條帶，然而熱啟動(dòng)酶能夠顯著地提升特異性，與此同時(shí)還要關(guān)注該試劑盒是否就包含dNTPs、Mg2+等這樣的組分，全預(yù)混液可是能簡(jiǎn)化操作步驟的，還會(huì)減少加樣誤差。
試劑盒由不同廠家生產(chǎn)，其擴(kuò)增效率以及保真度存有差異，針對(duì)需要進(jìn)行克隆測(cè)序的實(shí)驗(yàn)而言，應(yīng)當(dāng)挑選具高保真酶的試劑盒。常規(guī)檢測(cè)的話，能夠選用普通的Taq酶。此外，試劑盒的兼容性也是十分重要的，舉例來(lái)說(shuō)，是不是適配你所用PCR儀的升降溫速度，是不是需要對(duì)循環(huán)參數(shù)作出調(diào)整。建議先去查閱產(chǎn)品說(shuō)明，或者進(jìn)行小量試用。
PCR試劑盒使用注意
在使用試劑盒之前，一定要認(rèn)真仔細(xì)地讀完說(shuō)明書，留意各個(gè)組分各自的，用于儲(chǔ)備保存的條件。大體上來(lái)說(shuō)，酶這類和引物這般，需要在零下20攝氏度的環(huán)境溫度里進(jìn)行儲(chǔ)備保存，假如反復(fù)進(jìn)行冰凍再化凍的操作，會(huì)使酶其活性降低，故而建議將其分開(kāi)進(jìn)行裝盛以便于使用。展開(kāi)配制反應(yīng)體系的時(shí)候，要在冰塊之上進(jìn)行操作，并且嚴(yán)格嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貓?jiān)決避免發(fā)生污染情況，采用帶有過(guò)濾芯的槍頭以及專門專用的加樣區(qū)域，從而防止氣溶膠出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。
加樣的順序通常是先加進(jìn)去水，接著加緩沖液，然后加dNTPs，最后才加模板以及酶。模板DNA的純度還有濃度會(huì)對(duì)角直接產(chǎn)生影響擴(kuò)增效率，過(guò)量的模板會(huì)對(duì)反應(yīng)起到抑制作用。建議去設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以及陰性對(duì)照，用來(lái)驗(yàn)證試劑盒和操作流程的可靠性。退火溫度需要依據(jù)引物Tm值進(jìn)行優(yōu)化，能夠使用梯度PCR功能快速地找到最佳溫度。
PCR擴(kuò)增效率因素
致使PCR擴(kuò)增效率受到影響的主要因素涵蓋模板質(zhì)量、引物設(shè)計(jì)、循環(huán)參數(shù)以及試劑盒組分穩(wěn)定性，模板內(nèi)含有的蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑或者金屬離子雜質(zhì)會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用，所以提取DNA之后最好進(jìn)行那種目的在于提高純度的操作，引物二聚體或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)造成擴(kuò)增失敗的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候需要避開(kāi)互補(bǔ)序列，并且要將GC含量控制在40%至60%的范圍之內(nèi)。
循環(huán)次數(shù)一旦過(guò)多，就會(huì)積累非特異性產(chǎn)物，一般而言，25至35個(gè)循環(huán)就可以了。延伸時(shí)間需要依據(jù)目標(biāo)片段長(zhǎng)度來(lái)設(shè)定，通常每kb需要設(shè)定30至60秒。試劑盒中的Mg2+濃度是關(guān)鍵所在？過(guò)低會(huì)致使產(chǎn)物少，過(guò)高則會(huì)引發(fā)非特異性條帶。要是擴(kuò)增結(jié)果不理想，那么可以嘗試調(diào)整退火溫度或者更換更具高效性的試劑盒。
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