PCR試劑盒屬于分子生物學(xué)實驗室的基礎(chǔ)性工具范疇，挑選適宜的試劑盒這項行為，會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性以及可重復(fù)性產(chǎn)生直接影響。在本文之中，是依從實際去使用的角度入手，將不同類型的PCR試劑盒的特點以及適用場景進(jìn)行梳理，其目的在于助力實驗的相關(guān)人員能夠迅速地完成正確的選擇動作。
普通PCR試劑盒怎么選
常規(guī)基因擴(kuò)增適用普通PCR試劑盒，關(guān)鍵在于酶的性能以及緩沖液體系，Taq酶的熱穩(wěn)定性、延伸速率與保真度是首要考量指標(biāo)，高純度的酶可降低非特異性條帶出現(xiàn)概率，緩沖液的pH值和離子濃度對擴(kuò)增效率也存在影響，建議優(yōu)先選用預(yù)混型試劑，以此減少加樣步驟所產(chǎn)生的誤差。
對于那種模板方面比較復(fù)雜、或者GC含量處于較高水平的樣本，能夠選用添加了輔助因子的試劑盒。比如說含有甜菜堿或者DMSO的配方，是可以降低二級結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的影響的。另外，要去留意試劑盒是不是包含dNTPs和Mg2?，不同品牌的最佳工作濃度是存在差異的，按照說明書去優(yōu)化退火溫度就能夠獲得清晰條帶。
實時熒光PCR試劑盒原理
實時熒光PCR試劑盒，是在普通PCR之上，添加熒光染料或者探針，借由監(jiān)測熒光信號達(dá)成定量分析。SYBR Green法，成本比較低，適宜大量樣本的初步篩查，不過需要借助熔解曲線去確認(rèn)產(chǎn)物特異性。TaqMan探針法，靈敏度更為高，能夠同時檢測多個靶標(biāo)，適合多重?zé)晒鈱嶒灐?/p>
選擇這類試劑盒之際，需確認(rèn)熒光通道是不是同您的儀器相匹配，其常見通道包含，F(xiàn)AM、HEX、ROX等等，多色實驗要防止出現(xiàn)光譜重疊，試劑盒所提供的參比染料，像是ROX，用于矯正孔與孔之間的差距，對于ABI之類的儀器而言極為關(guān)鍵，預(yù)實驗一定要測試線性范圍以及檢測下限。
高保真PCR試劑盒用途
用于存在精確復(fù)制需求的場景比如基因克隆、定點突變還有序列驗證的是高保真PCR試劑盒，其里邊核心的是帶有校正功能的DNA聚合酶，這種酶能夠顯著地降低堿基錯配率，不同的產(chǎn)品在保真度方面的差異能夠達(dá)到10倍以上，在克隆長片段也就是大于3kb的時候推薦使用融合型聚合酶。
在實際應(yīng)用當(dāng)中，高保真酶的擴(kuò)增速度一般是比較慢的，延伸的時間需要適當(dāng)?shù)赜枰匝娱L。試劑盒所附帶的緩沖液大多已經(jīng)被優(yōu)化了，是不建議自行去調(diào)整Mg2?濃度的。要是擴(kuò)增產(chǎn)量比較低的情況下，能夠嘗試去增加循環(huán)數(shù)或者使用巢式PCR策略。需要注意的是高保真產(chǎn)物末端大多是平端，在連接T載體之前是需要進(jìn)行加A尾處理的。
快速PCR試劑盒時效優(yōu)勢
采用優(yōu)化酶以及緩沖體系的快速PCR試劑盒，把擴(kuò)增時間縮短在了30分鐘以內(nèi)。具備這類特性的產(chǎn)品，適用于針對大批量樣本展開篩查，或者適用于那些時效性要求較高的實驗，像是病原檢測以及環(huán)境監(jiān)測等?？焖倜傅难由焖俾誓軌蜻_(dá)到普通酶2至3倍的程度，然而退火時間一般情況下沒辦法進(jìn)行大幅度的壓縮。
進(jìn)行選擇之際，要對速度以及靈敏度加以權(quán)衡，那種超快速的試劑盒，興許會使得對于低拷貝模板的檢出率有所下降。建議首先運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品去驗證最低檢測限，接著再去決定是不是采用快速的流程。部分試劑盒是支持熱啟動技術(shù)的，能夠在常溫的狀態(tài)下配制反應(yīng)液，由此提升操作的便利性。針對珍貴樣本而言，依舊推薦采用常規(guī)速度，以此來保證數(shù)據(jù)的可靠性。
實際使用 PCR 試劑盒期間，您碰到過哪些棘手的擴(kuò)增方面的問題呢，歡迎于評論區(qū)分享您解決這些問題的經(jīng)驗喲。
