于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)里頭，時(shí)間常常是決定是否成功的關(guān)鍵要素。快速PCR擴(kuò)增試劑盒恰恰是為處理傳統(tǒng)PCR耗費(fèi)時(shí)間太久的問(wèn)題而規(guī)劃，它借由優(yōu)化的酶體系以及緩沖液配方，把原本兩三個(gè)小時(shí)的擴(kuò)增流程壓縮到半小時(shí)左右，極大地提高實(shí)驗(yàn)效率。
PCR快速擴(kuò)增原理
快速PCR試劑盒的關(guān)鍵部分是熱啟動(dòng)酶以及特殊添加劑共同發(fā)揮的作用，傳統(tǒng)Taq酶要有較長(zhǎng)的激活時(shí)間，還得有延伸步驟，快速試劑盒用的是改造后的聚合酶，在預(yù)變性之后可以很快達(dá)到最好的活性狀態(tài)，與此同時(shí)，緩沖液里的促溶劑與穩(wěn)定劑能夠把變性退火環(huán)節(jié)的保持時(shí)間縮短，讓每個(gè)循環(huán)從數(shù)分鐘變?yōu)槭畮酌搿?/p>
如何選快速PCR試劑盒
進(jìn)行選購(gòu)之時(shí)，需要著重去關(guān)注擴(kuò)增速度以及產(chǎn)物特異性這兩個(gè)指標(biāo)。對(duì)于不同品牌的快速試劑盒而言，其對(duì)模板濃度以及引物設(shè)計(jì)的要求是存在著差異的，建議先去查看產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)當(dāng)中的推薦參數(shù)，此后再結(jié)合自身的實(shí)驗(yàn)樣本開(kāi)展小規(guī)模測(cè)試。另外，試劑盒是不是附帶獨(dú)立的染料或者增強(qiáng)劑也是值得去留意的。
操作要點(diǎn)解析
采用快速試劑盒之際，退火溫度精準(zhǔn)設(shè)定極為關(guān)鍵，因循環(huán)時(shí)間大幅縮短，溫度變化對(duì)引物結(jié)合的影響被放大，故建議先借由梯度PCR確定最佳退火溫度且，模板投入量不宜過(guò)高，一般50微升體系里加入10到50納克基因組DNA便可滿足多數(shù)擴(kuò)增需求。
倘若出現(xiàn)并非特異性的條帶或者彌散拖尾的情況，那么可以試著把退火的溫度提升1到2度，且核查預(yù)變性的時(shí)間是不是足夠。針對(duì)于GC含量比較高的模板而言，推薦去選擇附帶GC緩沖液的快速試劑盒版本。除此之外，每一次的實(shí)驗(yàn)都應(yīng)該設(shè)置陰性對(duì)照，以此來(lái)排除因?yàn)闅馊苣z污染所導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。
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