在細胞培養(yǎng)以及生物制品生產(chǎn)當中，經(jīng)常會出現(xiàn)支原體污染這種情況，它是一種常見的隱患，PCR檢測法憑借著既能快速、精確檢測，又具有靈敏特性這樣的優(yōu)勢，從而成為了占據(jù)主導地位的手段。支原體PCR檢測試劑盒是這么回事，它借助擴增支原體保守DNA區(qū)域，以此達成要么能夠定性，不然能夠定量這種意義上的分析情形，正確地去選用試劑盒，對于結(jié)果可靠性而言，是有著極其關(guān)鍵的重要作用的。本文是從靈敏度、操作細節(jié)以及常見誤區(qū)這三個角度維度開始著手開展探索的，其目的在于協(xié)助實驗室人員，能夠以一種高效率的方式去優(yōu)質(zhì)完成檢測工作。
支原體PCR檢測試劑盒靈敏度如何
試劑盒靈敏度能不能辨別出低豐度污染起著直接導向作用，可以用來檢測界限，質(zhì)量有保證的試劑盒通常是可以達到10拷貝/反應以下的 ，需要在選購之時，留意觀察產(chǎn)品驗證數(shù)據(jù)，從而來確定是不是覆蓋平時常見的具備污染特性的支原體種類，似口腔支原體一般，如發(fā)酵支原體那樣，實際操作運作期間，樣本進行處理的步驟會對靈敏度產(chǎn)生作用引起變化，建議選購與試劑盒配套的具有高純度特性的DNA提取試劑，避免因抑制劑殘渣剩余造成錯誤的陰性結(jié)果。
進行日常檢測時，靈敏度不是越高就越好，過高的靈敏度有可能因為氣溶膠污出現(xiàn)假陽性結(jié)果，實驗室要分區(qū)操作還要設置陰性對照，對于常規(guī)細胞庫篩查，選擇檢測限處于50至100拷貝每反應的試劑盒已足夠，要是用于放行檢驗，那么優(yōu)先選用經(jīng)過第三方驗證的高敏版本，定期用弱陽性參考品監(jiān)控試劑盒批間差，確保結(jié)果穩(wěn)定。
怎樣避免支原體PCR檢測假陽性
擴增產(chǎn)物污染或者引物設計不特異常常致使假陽性出現(xiàn)。進行操作的時候要嚴格遵守“三區(qū)分離”規(guī)定，也就是試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增分析區(qū)這三個區(qū)域各自相互完全獨立分開，而且要使用帶有濾芯的吸頭以及專門規(guī)定的移液器。每一次進行實驗的時候都必須要包含無模板對照也就是NTC，如果NTC出現(xiàn)了Ct值，那么整整一批樣本的結(jié)果都通通作廢。與此同時，要挑選針對支原體16S rRNA或者23S rRNA保守區(qū)來設計的引物探針，并且要在BLAST數(shù)據(jù)庫里比對它的特異性。
樣本進行加熱滅活時，有可能會釋放出核酸酶，對此建議采用蛋白酶K進行消化之后，再通過95℃失活的方法來處理。另外，要避免在同一個超凈工作臺之內(nèi)，同時對陽性對照以及未知樣本進行處理。擴增完成以后，千萬不要打開蓋子，使用UNG酶體系能夠降解含有dUTP的擴增產(chǎn)物，可有效降低氣溶膠污染所帶來的風險。每周需要使用10%的漂白水擦拭臺面，并且還要用紫外燈照射過夜。
支原體PCR檢測需要多久出結(jié)果
傳統(tǒng)培養(yǎng)法所需時間為7至14天 ，然而PCR法卻大幅縮短到3至4小時。具體的時長是由試劑盒 的擴增程序來決定的：普通PCR需要1.5小時擴增再加上0.5小時電泳 ；實時熒光PCR也就是qPCR此時僅需要1至2小時 ，并且不需要進行后處理。要是樣本數(shù)量比較多 ，那就選擇預混即用型試劑盒 ，以此減少加樣步驟 ，整個過程能夠在2小時之內(nèi)完成。部分快速試劑盒甚至還提供30分鐘的快檢模式 ，適合緊急放行。
出結(jié)果的速度，是必要來顧及樣本這一頭做出來之前的處理步驟的。細胞上清液直接去進行裂解，僅僅需要10分鐘的時間；然而貼壁細胞這一方面，是需要先通過胰酶來做一番消化，接著開展離心富集操作的，這額外又增添了20分鐘的用時。針對那種呈現(xiàn)濃稠狀態(tài)的樣本（就好比疫苗原液這類），應當先去實施稀釋操作，或者采用磁珠法來提取DNA。建議實驗室依據(jù)日常通量的情況，去平衡速度以及成本：日常進行監(jiān)控的時候，選用普通PCR試劑盒就可以了；要是碰到突發(fā)污染需要排查，或者是大批量進行篩查之際，首選qPCR試劑盒并搭配自動化核酸提取儀。
檢測結(jié)果判讀有哪些注意事項
最先要去確認一下對照是不是處在受控狀態(tài)：陽性對照理應是有明顯的擴增曲線或者條帶的，陰性對照以及NTC是應該沒有信號的，要是陽性對照出現(xiàn)了失敗的情況那就去檢查試劑的保存溫度以及擴增儀的運行日志，要是陰性對照出現(xiàn)了擴增的現(xiàn)象，那就判定是環(huán)境污染了，需要重新去做實驗，對于臨界值樣本也就是Ct值在35到38之間的那種，建議去重復進行檢測并且制作熔解曲線分析也就是SYBR法或者開展測序驗證，以此來排除非特異性擴增。
不同廠家，試劑盒判讀標準，有可能存在差異，務必要按照說明書設定基線閾值。同時要注意，支原體種類繁多，部分試劑盒，僅檢測常見8 - 10種，若懷疑罕見種屬污染，應選用覆蓋更廣的通用型試劑盒。要記錄每次實驗的擴增曲線峰型，以及Ct值，還要建立實驗室內(nèi)部閾值數(shù)據(jù)庫。當檢測到陽性結(jié)果之后，建議聯(lián)合培養(yǎng)法，或巢式子PCR二次確認，并立即隔離污染源。
