用于分子生物學實驗的，常用的，擁有著高靈敏度特性的檢測技術，是探針法熒光定量PCR。它借助于特異性熒光探針，在擴增進程里發(fā)出信號，以此能夠對目標序列的擴增情形進行實時監(jiān)測。和染料法相比較而言，在多重檢測以及特異性這兩方面，探針法更具備優(yōu)勢。
探針法熒光定量PCR原理是什么
核心在于使用一條熒光標記探針來進行探針法，該探針與目標序列互補，其一端連接報告熒光基團，而另一端連接淬滅基團，當探針保持完整狀態(tài)時熒光會被淬滅，在PCR退火階段探針會和模板相結合，此階段過后進入延伸階段，這時DNA聚合酶的外切活性會把探針切斷，如此一來報告基團便會遠離淬滅基團進而發(fā)出熒光，熒光強度和擴增產(chǎn)物量成的是正比關系，借助標準曲線能夠實現(xiàn)絕對定量。
探針設計有哪些注意事項
探針的長度通常被控制在二十到三十個堿基，其Tm值比引物要高五到十攝氏度。要防止探針自身形成發(fā)夾結構或者二聚體，并且探針的GC含量以百分之四十到百分之六十為適宜。五端不能是G堿基，原因在于G會使熒光信號淬滅。同時要做到確保探針和模板結合位置完全匹配，單堿基錯配很可能致使信號大幅度下降。運用專業(yè)軟件比如Primer Express或者Beacon Designer能夠提高設計成功率。
如何優(yōu)化反應體系提高靈敏度
通常情況下，模板投入量是在10至100 ng這個范圍，要是過少的話，那么Ct值就會偏大，要是過多的話，有可能會抑制反應。引物濃度方面給出的建議是0.2至0.4 μM，探針濃度則是0.1至0.2 μM。采用熱啟動Taq酶能夠減少非特異性擴增。退火溫度要比探針Tm值低5至10℃，延伸時間30秒就可以了。添加低濃度ROX作為校正染料能夠消除背景波動。每次實驗都要設置無模板對照以及標準品梯度，以此來確保結果可靠。
結果異常時如何排查問題
要是擴增曲線呈現(xiàn)出非特異性峰，首先得去檢查引物二聚體，對引物重新進行設計或者把退火溫度給提高。要是陰性對照出現(xiàn)了信號，有可能是試劑被污染或者探針發(fā)生降解，需要將所有組分進行更換。當熒光信號過低的時候，要增加模板量或探針濃度，與此同時要確認熒光基團與儀器檢測通道相匹配。對于多重反應而言，不同探針之間需要借助交叉驗證來避免光譜重疊造成干擾。
