染料法qPCR試劑盒在基因表達定量分析里屬于極為常用的工具當(dāng)中的一個，它依靠熒光染料跟雙鏈DNA相結(jié)合以此適時監(jiān)測擴增產(chǎn)物。對于平常進行基因表達、基因分型或者病毒檢測的實驗室而言，挑選對一個可靠的試劑盒直接關(guān)聯(lián)到數(shù)據(jù)準確性與實驗重復(fù)性。
靈敏度夠不夠用
最低模板量能被檢測到與否取決于靈敏度，染料法依靠SYBR Green等染料和DNA相結(jié)合，低拷貝數(shù)目標易被背景信號淹沒，要是試劑盒的靈敏度不夠的話，實踐里建議先用標準品做梯度稀釋測試，看看試劑盒在10個拷貝以下能不能給出清晰的擴增曲線，很多試劑盒說靈敏度高，但其實際表現(xiàn)得看信噪比以及Ct值的線性范圍。
特異性如何保證
有著無法區(qū)分特異性產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物的染料法，會檢測到引物二聚體。所以，試劑盒的緩沖體系得能夠抑制非特異性擴增。優(yōu)秀的試劑盒會增添熱啟動酶以及優(yōu)化Mg2+濃度，致使引物于低溫時不能延伸。實施熔解曲線分析之際，單峰象征特異性良好，要是出現(xiàn)雜峰或者寬峰，表明試劑盒需升級或者引物設(shè)計存在問題。
重復(fù)性好不好
實驗重復(fù)性差常常是因為試劑一致性欠佳，或者抗干擾能力不強。不同批次的試劑盒，要是成分活性波動大，那么Ct值的批間差異就會超出0.5個循環(huán)。另外，樣本里可能殘留乙醇、苯酚等抑制劑，耐抑制性強的試劑盒方可保持擴增效率穩(wěn)定。選購的時候要求廠家給出多批次測試數(shù)據(jù)，或者自己用復(fù)雜樣本（像土壤DNA、血液DNA）來做比對。
操作便捷性高嗎
染料法qPCR試劑盒不少是采用預(yù)混液形式的，可是預(yù)混液里頭是不是涵蓋了所有必需的組分，也就是酶、緩沖液、dNTPs、染料，這直接對加樣步驟產(chǎn)生影響。全能型預(yù)混液只要加入引物、模板以及水就行，出錯的概率更低。另外還要留意是不是適合快速程序，有些試劑盒能夠把退火延伸合并成一步，進而將總體的時間從2小時壓縮至40分鐘。挑選跟自身qPCR儀器相兼容的ROX參比染料類型也是相當(dāng)關(guān)鍵的。
