細(xì)胞培養(yǎng)以及生物制品生產(chǎn)里常見的問題是支原體污染，PCR檢測試劑盒因具備快速、靈敏這樣的特點(diǎn)，成為實(shí)驗室日常監(jiān)測的重要工具，正確選擇且使用這類試劑盒，能夠有所成效地得到提升檢測準(zhǔn)確性，減少假陽性或者假陰性結(jié)果所帶來的困擾。
支原體PCR檢測試劑盒的原理是什么
利用特異性引物，對支原體基因組里的保守區(qū)域，像16S rRNA基因，進(jìn)行擴(kuò)增，借助PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)微量核酸檢測。和傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或者染色法相比較，PCR方法完成檢測無需活的支原體，整個流程一般只需2至3小時。當(dāng)前市面上售賣的試劑盒大多采用熒光定量PCR或者常規(guī)PCR形式，前者能實(shí)時去觀察擴(kuò)增曲線，后者則憑借凝膠電泳來判讀結(jié)果。了解基本原理能夠幫助實(shí)驗人員依據(jù)自身實(shí)驗室條件挑選合適的產(chǎn)品。
試劑盒操作步驟復(fù)雜嗎
已預(yù)混好酶以及緩沖液的大部分商品化試劑盒，用戶只要加入樣本核酸就能上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)程序涵蓋樣本采集，核酸提取，PCR體系配制，擴(kuò)增反應(yīng)以及結(jié)果判讀。核酸提取乃是影響成敗的關(guān)鍵一步，建議運(yùn)用試劑盒配套的提取液，防止樣本里抑制劑對擴(kuò)增造成干擾。對于沒有提取步驟的直擴(kuò)型試劑盒，就得嚴(yán)格把控加樣體積，避免細(xì)胞上清中的蛋白質(zhì)或者鹽分對聚合酶活性產(chǎn)生影響。熟練的操作人員能夠在1小時內(nèi)完成全部加樣以及上機(jī)設(shè)置。
如何避免假陽性或假陰性結(jié)果
常見于氣溶膠污染或者引物設(shè)計不合理的情況是假陽性，解決辦法有分區(qū)操作，使用帶濾芯吸頭，以及定期用紫外燈照射操作臺。假陰性有可能源于樣本保存不當(dāng)或者支原體數(shù)量過低，建議采集培養(yǎng)上清時避開已變色的陳舊培養(yǎng)基，并且在收集后盡快檢測。要是發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常，可增設(shè)內(nèi)參基因監(jiān)控整個流程，比如在反應(yīng)體系中加入人工合成的質(zhì)粒作為陽性對照。每個批次實(shí)驗都應(yīng)該包含陰性對照和弱陽性對照，以便能夠及時發(fā)現(xiàn)問題所在。
檢測靈敏度能否滿足實(shí)驗室需求
能達(dá)到10 copy/反應(yīng)這樣檢測下限的主流支原體PCR試劑盒，足以將大部分常見支原體種類檢出，與之相比，傳統(tǒng)培養(yǎng)法需耗時5 - 7天且針對某些難培養(yǎng)菌株不敏感，而PCR方法不但節(jié)省時間，還可同時檢測豬鼻支原體、口腔支原體等8種以上亞型，對于細(xì)胞庫放行、病毒種子批檢測等情況，建議搭配嵌套PCR或熒光探針法來進(jìn)一步提高特異性，選購時要留意產(chǎn)品說明書標(biāo)明的靈敏度數(shù)據(jù)，并用自身的樣本基質(zhì)去驗證。
