與我一同在大學(xué)就讀的老張，于上海張江的某一家生物技術(shù)公司里開展研發(fā)工作，他所負(fù)責(zé)的是同細(xì)胞生物學(xué)存在關(guān)聯(lián)的支撐方面的工作，在這一領(lǐng)域已然從事了將近六年時(shí)間，前段時(shí)間彼此碰面之際，他朝著我傾訴了諸多苦惱之事，皆是關(guān)于腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)的那些情況，聽完之后我認(rèn)為，好多剛剛步入此行的朋友或許也正在歷經(jīng)相似的困惑，在此將他真實(shí)經(jīng)歷以及解決辦法書寫出來，期望能夠給予大家些許參考。
腫瘤細(xì)胞株污染怎么發(fā)現(xiàn)
老張所在公司去年承接了一個(gè)新項(xiàng)目，此項(xiàng)目需要用到一株人源的腫瘤細(xì)胞株。老板從合作方那兒取得了凍存管，老張開展解凍復(fù)蘇操作后，細(xì)胞狀態(tài)看上去還算可以。然而養(yǎng)到第三代，他起始發(fā)覺存在異常狀況。培養(yǎng)液變色相較平常要快，于顯微鏡下進(jìn)行觀察時(shí)，背景里有一些細(xì)小的顆粒正在移動(dòng)。老張當(dāng)時(shí)心里猛地下沉，這極有可能是支原體污染。
他馬上就用試劑盒開展了檢測(cè)，其結(jié)果確實(shí)是陽性。那一批細(xì)胞通通都得扔掉，實(shí)驗(yàn)室也得進(jìn)行徹底消毒。老張那幾日整個(gè)人的狀態(tài)都欠佳，項(xiàng)目進(jìn)度整整耽誤了兩周。他隨后回顧反思了一番，覺得問題或許出在凍存管自身，又或是復(fù)蘇操作的時(shí)候出現(xiàn)了交叉污染。從那個(gè)時(shí)候開始，他給自己制定了一條規(guī)則：任何外來的腫瘤細(xì)胞株，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室都必須先進(jìn)行隔離培養(yǎng)，做完支原體檢測(cè)以及STR鑒定之后才能夠進(jìn)入常規(guī)操作間。
2025年7月，某天下午，老張于浦東的實(shí)驗(yàn)室里，跟我進(jìn)行視頻，他指著培養(yǎng)箱說道，“你瞧瞧旁邊那臺(tái)小的，那是專門用以隔離新來的細(xì)胞的?！彼麑⑦@個(gè)流程稱作“檢疫期”，通常起碼一周。在這期間，要是發(fā)現(xiàn)任何異常，便能及時(shí)止損，不會(huì)污染其他細(xì)胞株。正是那次教訓(xùn)之后，他所在的團(tuán)隊(duì)，再也未曾因外來污染致使大規(guī)模報(bào)廢。
腫瘤細(xì)胞株特性改變?cè)趺崔k
那株好不容易才穩(wěn)定下來的腫瘤細(xì)胞株，傳到第十代左右的時(shí)候，生長速度突然變慢了，以前48小時(shí)就能傳代，現(xiàn)在卻要將近72小時(shí)，而且細(xì)胞形態(tài)同之前也不一樣了，從原本比較均一的圓形，變成了有些拉長的梭形，解決了污染問題后，老張又碰到了新麻煩。
在最開始的時(shí)候，老張覺得是培養(yǎng)條件方面出現(xiàn)了問題，像是血清批次存在差異，又或者二氧化碳濃度出現(xiàn)波動(dòng)，使得情況變得不太對(duì)勁。他針對(duì)孵育箱的各項(xiàng)參數(shù)，進(jìn)行了反反復(fù)復(fù)的排查工作，并且還更換了不同批次的培養(yǎng)基，然而狀況并沒有獲得明顯的增進(jìn)。后來呀，他專門去請(qǐng)教了一位在另外一個(gè)園區(qū)開展工作的前輩，那位前輩跟他講，腫瘤細(xì)胞株在長時(shí)間傳代的進(jìn)程當(dāng)中發(fā)生遺傳漂變，這是極為平常的事情。某些亞群會(huì)逐漸地占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，進(jìn)而致使整體特性得到改變。
早期凍存種子被前輩建議他回去找，老張把液氮罐里的記錄本翻出來，項(xiàng)目剛開始時(shí)凍存的第一批細(xì)胞被找到，大概在第五代左右，那一批他復(fù)蘇了，一切果然恢復(fù)正常，從那以后，老張有了個(gè)習(xí)慣，每一株腫瘤細(xì)胞株拿到后盡快擴(kuò)大培養(yǎng)并大量凍存早期代次的種子，每次實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞傳代不超過十五代，用完就重新復(fù)蘇早期種子，這個(gè)辦法幫他避免了很多重復(fù)性失敗。
腫瘤細(xì)胞株活力低下的原因
過去一年的年末時(shí)分，老張所負(fù)責(zé)的一個(gè)具備較強(qiáng)時(shí)效性的項(xiàng)目，需要運(yùn)用到貼壁的腫瘤細(xì)胞株。他依據(jù)常規(guī)的操作流程進(jìn)行消化離心，之后重新開展接種工作，然而卻發(fā)覺細(xì)胞的貼壁率相當(dāng)?shù)?，到了第二天查看時(shí)存在不少處于懸浮狀態(tài)的死細(xì)胞。他嘗試了數(shù)次，即便在最好的情形下，貼壁率也僅僅只有百分之六十左右。
開始懷疑胰酶消化時(shí)間掌握得是否不好的老張，專門拿了兩瓶同一代次的細(xì)胞去做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中一瓶消化兩分鐘，另一瓶則消化五分鐘，結(jié)果是兩分鐘那瓶的貼壁率明顯高于五分鐘那瓶。他意識(shí)到以前的想法是總覺得消化時(shí)間久一點(diǎn)才能把細(xì)胞全部吹下來，可實(shí)際上消化過度會(huì)損傷細(xì)胞膜表面的黏附蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞很難重新貼壁。
一個(gè)上午，那是二零二六年一月。我于微信向他設(shè)問近況如何，他傳來一張顯微鏡照片，其上細(xì)胞貼壁整齊，狀態(tài)良好。他言及隨后其將胰酶濃度，從百分之零點(diǎn)二五降至百分之零點(diǎn)零五，于室溫下把消化時(shí)間控制在一分半鐘，瞅見細(xì)胞變圓卻未完全脫落便以血清中和。此方法被寫進(jìn)他們實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)范，新來的同事依樣施行，之后基本上未曾再出現(xiàn)貼壁率低的狀況。
做好腫瘤細(xì)胞株的日常記錄很重要
老張講，他所踩得這些坑，根本原因是早期對(duì)記錄欠缺重視。就像那次支原體污染，他翻遍工作日志，都沒找出到底是哪一步操作在哪一天出的問題。后來他換成電子版記錄表格，每一管腫瘤細(xì)胞株的傳代日期要填進(jìn)去，代數(shù)要填進(jìn)去，培養(yǎng)基批號(hào)要填進(jìn)去，消化時(shí)間和溫度要填進(jìn)去，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果也要填進(jìn)去。
曾有一回他察覺到有一瓶細(xì)胞的代數(shù)記錄存在前后不一致的狀況，朝著前面追溯探尋才發(fā)覺是同事把編號(hào)寫錯(cuò)了。要是沒有完備的記錄，壓根就沒有辦法確定問題所在。如今老張所在的那個(gè)實(shí)驗(yàn)室，每一個(gè)人在拿取細(xì)胞之前都得進(jìn)行掃碼，與細(xì)胞凍存管上的條形碼相互對(duì)應(yīng)。系統(tǒng)會(huì)自行記錄取出的時(shí)間以及操作的人員。這個(gè)看似有些繁雜瑣碎的做法，實(shí)際上為他們節(jié)省了諸多后續(xù)排查所需要的時(shí)間。
腫瘤細(xì)胞株凍存液怎么配
還跟我分享了一個(gè)細(xì)節(jié)的是老張，早期他們實(shí)驗(yàn)室所使用的凍存液配方乃是胎牛血清與二甲基亞砜，比例為九比一，然而這個(gè)配方對(duì)于某些腫瘤細(xì)胞株來講過于“猛烈”，復(fù)蘇之后活率僅僅只有百分之六十多，他嘗試著采用商品化的無血清凍存液，成本提高了不少，不過對(duì)于珍貴的細(xì)胞株而言是值得的。
過后他尋得一個(gè)折中的辦法，對(duì)于較難培育的細(xì)胞，采用百分之九十的完全培養(yǎng)基，再加上百分之十的二甲基亞砜，此外還添加百分之五的蔗糖。 這個(gè)配比是他源自一篇技術(shù)手冊(cè)所見到的。嘗試之后，復(fù)蘇活率能夠穩(wěn)定處于百分之八十五以上。 當(dāng)然，不同的腫瘤細(xì)胞株或許適配不同的配方，所以他會(huì)依據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行微調(diào)，并且將每次的配方記錄下來歸案。
腫瘤細(xì)胞株交叉污染的預(yù)防
經(jīng)歷是老張講的一個(gè)他曾險(xiǎn)些犯下大錯(cuò)的，具體是有一回同時(shí)操作兩株腫瘤細(xì)胞株，其中一株是人源的，另一株是鼠源的。他在超凈工作臺(tái)里加完人源細(xì)胞的培養(yǎng)液后，沒換移液管就徑直去加鼠源細(xì)胞的瓶子里。多虧旁邊同事提醒了一下，他才反應(yīng)過來。要是那根移液管真伸進(jìn)去了，兩株細(xì)胞就會(huì)交叉污染，后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都將作廢。
那天過后，老張給自身定下一個(gè)硬性規(guī)矩，即操作各異的腫瘤細(xì)胞株時(shí)，務(wù)必要更換手套與移液管，并且從原則上講，不同細(xì)胞株不可以同時(shí)于同一臺(tái)超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作。倘若確實(shí)有同時(shí)開展操作的需求，仍舊要先完成一株細(xì)胞株的操作，將臺(tái)面徹底清理干凈之后，再著手處理下一株細(xì)胞株。如今，他把這個(gè)習(xí)慣要求實(shí)驗(yàn)室的新人嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行。
學(xué)會(huì)利用細(xì)胞庫的資源
老張告知我，實(shí)際上諸多有關(guān)腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)的痛點(diǎn)，均可借助查閱權(quán)威細(xì)胞庫的技術(shù)資料予以解決。像美國模式培養(yǎng)物集存庫與歐洲細(xì)胞庫，其網(wǎng)站會(huì)公開每一株細(xì)胞的培養(yǎng)條件，傳代比例、凍存液配方；以及常見問題的解決方案。老張以往碰到問題習(xí)慣于自己埋頭嘗試，后來發(fā)覺大部分問題他人早已碰到過，且已撰寫成操作指引。
2025年10月，他們的實(shí)驗(yàn)室，需要新引入一株比較難養(yǎng)，的腫瘤細(xì)胞株。老張?zhí)崆盎艘粋€(gè)周末，把那株細(xì)胞在細(xì)胞庫網(wǎng)站上的所有資料，都看了一遍，還下載了相關(guān)的操作視頻。等到細(xì)胞實(shí)際到貨后，他按照資料里的建議，用包被了多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶，來增加貼壁能力，培養(yǎng)基里額外加了非必需氨基酸。那份細(xì)胞在他的手里養(yǎng)得非常好，老板也夸他這次準(zhǔn)備充分。
現(xiàn)如今，老張常常講，從事腫瘤細(xì)胞株這一領(lǐng)域，僅僅依靠一味地埋頭努力干活是不行的，得善于從過往的經(jīng)歷當(dāng)中進(jìn)行歸納總結(jié)，并且還要明白借助先輩們所積累的成果，他把自身的失敗事例以及成功個(gè)例都記錄在了實(shí)驗(yàn)室的共享文檔里面，期望后續(xù)的同事能夠避免走過多的冤枉路，要是你同樣在開展類似的工作，不妨對(duì)自己提出這些疑問：你的凍存種子庫是否足夠處于早期階段？你的污染檢查是按照固定周期去做的嗎？你所做的每一種操作流程都有著清晰的記錄嗎？把這些問題思考透徹了，許多原本令人頭疼不已的問題便會(huì)輕松得到解決。
