年后復(fù)工的第一天，我接到了老同學(xué)大劉打來的電話。在電話那頭，他不停地嘆氣，聲稱最近實驗數(shù)據(jù)始終處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，而且團隊已經(jīng)毫無間斷地連續(xù)加班兩周時間了。
于一家生物技術(shù)公司身為研發(fā)組長的大劉，負責(zé)的是食品安全檢測方面。他講年前承接了一個新項目，此新項目需要運用ELISA試劑盒去做樣品的篩查，然而所買回來的那試劑盒卻是問題接連不斷。
我向他詢問究竟是怎么一回事。所講的是這批試劑盒的靈敏度處于不夠的狀態(tài)，，標(biāo)準曲線做出來呈現(xiàn)出線性非常差的情形 ，甚至陰性對照出現(xiàn)了假陽性的狀況。在四月份的那個時候 ，他連續(xù)三天都沉浸在實驗室之中，，更換了三個批次的試劑盒 ，然而結(jié)果都沒有達到理想的程度。
聽說他這般講，我反倒記起自身往昔于實驗室所遭遇的那些失誤，ELISA試劑盒此物，看起來操作簡便易行，然而稍有疏忽便會陷入各類圈套之中。
標(biāo)準曲線線性差怎么辦
大劉講，他們碰到的首個問題便是，標(biāo)準曲線弄不平。依照說明書去操作，把系列稀釋后的標(biāo)準品加進去后，當(dāng)顯色了再讀板，算出的R平方值老是要比0.98低。
他們懷疑過自己加樣不準，也重新校準過移液器。但問題依舊。
此后經(jīng)過認真仔細地排查方知曉，乃是試劑盒儲存方面出現(xiàn)了狀況。供應(yīng)商發(fā)貨之際采用了普通泡沫箱搭配冰袋，送達實驗室的時候冰袋業(yè)已融化了大半。試劑于運輸進程當(dāng)中反復(fù)經(jīng)歷凍融，抗體活性減損顯著。
大劉這才發(fā)覺，購買ELISA試劑盒之時，單單瞅價格及靈敏度參數(shù)是不行的，供貨商所具備的冷鏈運輸能力同樣是很重要的，自那天開始，他們公司內(nèi)部將運輸條件審核增添到了采購流程之中。
高背景噪音如何降低
高背景同樣是大劉涉足過的又一陷阱，四月中旬時分，他們更換了一家供應(yīng)商去展開對比測試，在顯色完畢之后，空白孔的吸光度數(shù)值竟然達到了0.3，遠遠地超過了正常范疇。
他們依照常規(guī)的思考路徑，拔高了洗板的次數(shù)指標(biāo)，還拉長了封閉的時間長度，然而背景卻未能降低下來。大劉引領(lǐng)著團隊開展了一回涵蓋全部流程的復(fù)盤操作。
查出問題存在于檢測抗體方面，那款試劑盒所采用的是生物素標(biāo)記的檢測抗體，此檢測抗體得配合鏈霉親和素 - 辣根過氧化物酶來使用，然而說明書當(dāng)中的推薦稀釋比例并不契合他們的樣本類型。
之后，他們憑借自身力量運用棋盤滴定法再度對抗體以及酶標(biāo)試劑的工作濃度實施了重新優(yōu)化，如此一來，背景才得以降低。大劉發(fā)出感慨表示，ELISA試劑盒并非是毫無條件拿來便能夠使用之物，特別是針對復(fù)雜樣本來說，倘若不開展預(yù)實驗就直接進行批量操作，那么所面臨的風(fēng)險是極大的。
批間差太大合不合格
四月下旬的時候，大劉他們最終成功跑通了一組看上去還不錯的數(shù)據(jù)。然而新的問題出現(xiàn)了：新采購的試劑盒是同一品牌且同一貨號，不過屬于不同批次，測出來的結(jié)果差異十分顯著。
在第一批次所做的標(biāo)準曲線里，處于中段位置的濃度點，其OD值是1.2 ，當(dāng)把這個濃度點換到第二批次時，該濃度點的OD值卻變成了0.9 ，將其換算成樣本濃度后，誤差接近于百分之三十。
他們帶著數(shù)據(jù)，去跟供貨商進行溝通，供貨商調(diào)出了出廠時的質(zhì)控報告，聲稱兩個批次都處于合格范圍之內(nèi)，然而大劉的心里是明白的，這個范圍所允許的偏差，對于他們的項目來講實在是太大了。
最後，他們行了一項決定，針對已驗證方法學(xué)的項目，一次性採購能夠完成整個研究週期的同一批次ELISA試劑盒。如此一來，雖然佔用了部分倉儲空間，卻避免了批次差異導(dǎo)致數(shù)據(jù)無法合併的狀況。
怎么判斷試劑盒失效
據(jù)說大劉講以前，那評判試劑盒質(zhì)量優(yōu)劣的時候，僅僅盯著有效期來看。然而，歷經(jīng)這幾回的教訓(xùn)之后啵，如今他們已然擁有了一套涵蓋于內(nèi)部的驗收流程。
他們會對新到的試劑盒先做一個快速驗證，這個驗證是用標(biāo)準品做一條簡化的四濃度點曲線，并且同時測一個已知濃度的質(zhì)控品如果，這個質(zhì)控品的回收率處在百分之八十五到百分之一百一十五之間，而且標(biāo)準曲線斜率跟之前批次的歷史數(shù)據(jù)偏差不超過百分之十五，這樣才算通過。
這套流程，視覺上看，似乎多耗費了半天的時長，然而，卻免除了后續(xù)極有可能出現(xiàn)的、會造成浪費的幾周返工用時。
五月上旬的時候，大劉再度給我撥了一通電話。他講項目最終進展到正式開展篩查的階段了，首批樣品的數(shù)據(jù)在重復(fù)性方面表現(xiàn)得相當(dāng)不錯。
在電話里頭，他面帶笑容地講著，以往一直覺得ELISA試劑盒屬于成熟的產(chǎn)品，閉著眼睛去購買就可以了。然而呢，到如今才明白，挑選對試劑盒，采用對方法，做好質(zhì)量控制，每一個步驟都絕對不能有絲毫馬虎呀。
很多從事免疫檢測工作的朋友經(jīng)歷過和大劉類似的情況，ELISA試劑盒作為看似標(biāo)準化的產(chǎn)品，在實際使用時存在的變數(shù)比說明書所呈現(xiàn)的更為多樣。
從運輸保存起始，直至操作細節(jié)之處，從批次驗證開始，一直到樣本處理階段，任何一個環(huán)節(jié)倘若出現(xiàn)問題，均會對最終結(jié)果造成影響。期望大劉的這些歷經(jīng)波折獲得的經(jīng)驗，能夠給正在開展實驗的你帶來些許靈感啟發(fā)。
針對于ELISA試劑盒的挑選以及運用，每一個實驗室都存有自身的體會。要是你同樣擁有類似的經(jīng)歷或者期望知曉更多的實際的操作細節(jié)，那就歡迎將這篇文章收藏起來，并且轉(zhuǎn)發(fā)給身旁需要避開陷阱的友人。
