為什么我的細胞株總是狀態(tài)不好？
我有個朋友叫老陳，在蘇州一家生物技術(shù)公司負責(zé)上游工藝開發(fā)。
明明講的是“工藝開發(fā)”，然而實際上，每日與細胞株打交道所耗費的時間，相較于與家人相處的時間還要更多呢。
他時常跟我述說不滿：“培育細胞恰似照管小孩，你投入十足的心思，它不見得會給予你十足的回饋；然而稍有一點不小心大意，它就會死在你面前給你作一作樣子瞧?！薄?/p>
今年年初，公司接了個新項目，要做一款重組蛋白。
老陳負責(zé)篩選和生產(chǎn)用細胞株。
當(dāng)時，他手上有一個現(xiàn)成的CHO - K1細胞株，此細胞株是從國內(nèi)一家供應(yīng)商那里購買得到的，其傳代記錄書寫得極為清晰明白，而且凍存管上面的標(biāo)簽也是規(guī)規(guī)矩矩、整整齊齊的。
他覺得問題不大，直接擴增培養(yǎng)，準(zhǔn)備做瞬時轉(zhuǎn)染測試。
話說在結(jié)果轉(zhuǎn)染之后的第三天，他去查看細胞狀態(tài)，這一看，差點沒直接把培養(yǎng)瓶給扔出去，為啥呢？因為此時細胞呈現(xiàn)出聚集成團的狀況，并且其邊緣并不清晰，而且能肉眼明顯看出細胞活力在往下降嘍。
他趕緊做了臺盼藍染色，計數(shù)儀一報：活力只有68%。
正常CHO細胞轉(zhuǎn)染后活力怎么也該在85%以上。
老陳心里咯噔一下。
他檢查了培養(yǎng)基、二氧化碳濃度、溫度，都沒問題。
又做了支原體檢測，陰性。
細胞株身份鑒定有必要做嗎？
他開始懷疑細胞株本身。
說實話，很多做工藝的人不太重視細胞株的“身份”。
大家默認買回來的細胞就是對的，傳代過程中也不會出錯。
但是，老陳先前聽聞有一位前輩講過這樣的話語，是什么話語，那就是你始終都沒辦法曉得，在前一個人進行操作期間，是不是存在拿錯凍存管的情況。
他翻出那批細胞的入庫記錄。
入庫的時間呢，是在2025年11月這個階段，那時僅僅進行了活力檢測，以及支原體檢測，然而并沒有去做短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定。
關(guān)于短串聯(lián)重復(fù)序列的鑒定，這屬于細胞株進行“DNA指紋”方面的內(nèi)容，通過它能夠確認該細胞株究竟是不是人們期望得到的細胞株。
老陳送了幾份樣品到第三方檢測機構(gòu)。
等了三天，結(jié)果出來了，他一下子傻了眼，細胞株的短串聯(lián)重復(fù)序列圖譜，和CHO - K1標(biāo)準(zhǔn)圖譜，存在三個位點不匹配的情況。
就是說，他喂養(yǎng)了三個月之久的那個“CHO-K1”，事實上壓根就不是CHO-K1，沒錯吧。
可能是在傳代這個過程當(dāng)中，混入了別的細胞，也可能是供應(yīng)商在當(dāng)初的時候，就標(biāo)錯了。
老陳給我打電話的時候，聲音都是啞的。
他說：“三個月，幾十瓶細胞，幾千毫升培養(yǎng)基，全白干了。”
更麻煩的是，他用這批細胞做的瞬轉(zhuǎn)表達數(shù)據(jù)，全部作廢。
項目進度直接倒推三個月。
如何挑選靠譜的細胞株供應(yīng)商？
那段時間老陳天天帶著團隊重新篩選細胞株。
他這次學(xué)聰明了，不貪便宜也不圖省事。
他列了一份供應(yīng)商評估清單。
看供應(yīng)商是否提供短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定報告。
正規(guī)的細胞株供應(yīng)商，每一批次的凍存管在出廠以前，都要去做短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定，鑒定之后報告將會隨著貨物一起發(fā)出。
看傳代歷史記錄。
對于好的供應(yīng)商而言，會將細胞株的來源清晰地進行標(biāo)注，會明確最初分離的時間，會說明已傳代的次數(shù)，會表明有無克隆篩選這一過程。
后來，老陳選取了一家作為美國ATCC官方代理的機構(gòu)，盡管與之前那家相比，其價格翻了一番，然而，每一管進行凍存的細胞，皆附帶有著完整的鑒定文件以及質(zhì)檢報告。
看支原體、細菌、真菌檢測結(jié)果。
他特地向供應(yīng)商提出要求，要其給出最近三個月的環(huán)境監(jiān)測方面的數(shù)據(jù)，以及批量放行的檢測結(jié)果。
存有一些小供應(yīng)商會取用半年之前制作的報告以此來充當(dāng)實際情況，然而細胞株要是在了液氮之中擺放的時間比較久遠，要是管壁密封性出現(xiàn)了問題，那么在解凍之后依舊會遭受污染。
此次老陳挑選得出的供應(yīng)商那頭，針對所提供的每一批凍存管，均開展了直接培養(yǎng)法以及熒光染色法這樣兩種方式的支原體檢測操作，只有檢測結(jié)果呈現(xiàn)為陰性狀態(tài)的情況下，才會予以放行處理。
細胞株傳代操作有哪些容易忽略的細節(jié)？
細胞株買回來只是第一步。
老陳重新梳理了細胞房的操作規(guī)程。
以前他為了省時間，一個生物安全柜里同時操作兩三個細胞株。
盡管采用了各異的移液管，然而空氣的流通以及飛濺的風(fēng)險實際上沒辦法做到全然隔離。
有一回，他弄完A細胞株后，手套的表面興許沾附上了細胞懸液，隨后沒有更換手套便徑直去拿B細胞株的培養(yǎng)瓶，最終交叉污染竟如此這般地出現(xiàn)了。
現(xiàn)在他規(guī)定：一個生物安全柜同一時間段只操作一個細胞株。
操作完徹底清潔臺面，紫外照射至少15分鐘，才能換下一個。
他給每一個細胞株都配備了專門用于培養(yǎng)的瓶子，以及專門用于酶解細胞的那種瓶子，這兩種都是專用的，在瓶子的身上，用帶有不同顏色的那種標(biāo)簽來進行區(qū)分。
培養(yǎng)基，每次僅去分裝出一周的用量，剩余的，鎖在專門的冰箱里頭，防止反復(fù)開啟從而造成污染。
傳代時，他要求所有操作必須在火焰旁進行。
瓶口過火不能少于三秒，移液管不能碰到瓶口外壁。
聽上去全都是基本功，然而呢，從事工藝的那些人都清楚，接連進行操作十次不出現(xiàn)差錯是比較容易的，而連續(xù)操作一百次都不出現(xiàn)差錯則是困難的。
在2026年1月12日，那個時候老陳，由于著急去做一批轉(zhuǎn)染，在傳代之際，手速過快，沒有等到酒精揮發(fā)完畢，就開啟了瓶蓋，結(jié)果呢，那一批一共整六瓶的細胞，全部都被染上了霉菌。
顯微鏡下能清楚看到菌絲。
他后來在記錄本上寫了一句：“快就是慢，慢就是快?！?/p>
細胞株凍存和復(fù)蘇怎樣保證高活率？
細胞株凍存復(fù)蘇的細節(jié)，老陳以前不太在意。
他覺得液氮溫度夠低，細胞扔進去就行。
可是有一回，他從液氮罐當(dāng)中拿出一根凍存管，緊接著直接丟進37度的水浴鍋，結(jié)果呢，管壁由于溫差過大，一下子就爆裂了。
細胞懸液濺得到處都是，不僅細胞沒了，還差點污染整個水浴鍋。
后來他專門去請教了一位有十幾年經(jīng)驗的上游工藝專家。
專家告訴他幾個關(guān)鍵點：
凍存時，細胞要處于對數(shù)生長期，活力不低于95%。
用于凍存的液體是由百分之九十的胎牛血清以及百分之十的二甲基亞砜所構(gòu)成的，添加二甲基亞砜的時候呢，需要緩慢地進行滴加操作，在滴加的過程當(dāng)中還要一邊進行搖晃動作，以此來避免局部的濃度過高進而對細胞造成損傷影響。
放入程序降溫盒的凍存管，于-80度冰箱放置過夜，接著，第二天再將其轉(zhuǎn)入液氮氣相存儲層。
直接扔入液氮液相是絕對不行的，因為液相溫度為零下一百九十六度，那兒降溫速度過快，細胞內(nèi)部冰晶會將細胞膜刺破。
在進行復(fù)蘇操作時，要從液氮之中把凍存管取出來，隨后馬上將其放置到37度的水浴鍋里面，接著輕輕地進行搖動，當(dāng)管底最后那一小塊冰融化掉之后就立即把它取出來。
采用75%酒精對管壁予以擦拭，隨后，于生物安全柜之中，把細胞懸液緩緩地添加至預(yù)熱好的培養(yǎng)基里。
培養(yǎng)基里最好加10%胎牛血清，幫助細胞修復(fù)凍存損傷。
老陳依照這個辦法，于2026年2月18日，使一批新的CHO - S細胞株得以復(fù)蘇。
解凍后活力檢測，93%。
他當(dāng)時差點哭出來。
細胞株穩(wěn)定性測試到底該怎么做？
細胞株篩選出來后，老陳沒有急著做大規(guī)模生產(chǎn)。
他先做了穩(wěn)定性測試。
好多人覺得細胞株批與批之間，表達量保持穩(wěn)定就可以，然而在實際的操作進程當(dāng)中，細胞株于傳代的過程里，會出現(xiàn)遺傳漂變的情況。
尤其是超過30代以后，有些克隆的優(yōu)勢生長會改變?nèi)后w特征。
老陳的做法是：從原始細胞庫取一支凍存管，擴增建立主細胞庫。
主細胞庫分裝100支凍存管，全部保存在液氮氣相。
然后從主細胞庫取一支，擴增建立工作細胞庫。
工作細胞庫同樣分裝100支。
每次生產(chǎn)前，從工作細胞庫取一支復(fù)蘇，連續(xù)傳代到目標(biāo)代次。
他提出要求，針對于細胞株，要在目標(biāo)所處的代次范圍之內(nèi)，每隔5代時，進行一次取樣操作，以此來檢測表達量以及產(chǎn)物質(zhì)量。
確切的做法如下：于第0代的時候進行瞬時轉(zhuǎn)染，在第5代的時候開展瞬時轉(zhuǎn)染，在第10代的時候搞瞬時轉(zhuǎn)染，在第15代的時候去做瞬時轉(zhuǎn)染，于第20代的時候?qū)嵤┧矔r轉(zhuǎn)染，進而去檢測目標(biāo)蛋白那種物質(zhì)的表達量，以及聚體、碎片等這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性。
如果任意兩個代次之間，其表達量的變化超出了百分之二十，又或者質(zhì)量屬性呈現(xiàn)出顯著有別的狀況，那么這批細胞株就無法被用于生產(chǎn)。
2026年3月初時，老陳完成了一組測試，他的CHO-S細胞株，到第 20代的時候，表達量僅僅下降了8%，并且聚體比例一直控制在3%以下。
這才松了口氣。
細胞株污染后除了扔掉還能怎么辦？
但好事多磨。
2026年4月中旬，老陳的細胞房再次出現(xiàn)污染。
這次不是霉菌，而是細菌。
相繼有三瓶處于工作狀態(tài)的細胞庫中的細胞，在經(jīng)過解凍操作的次日，培養(yǎng)基隨即出現(xiàn)變渾濁的情況，緊接著pH值從7.2下降至6.5以下。
老陳沒有急著把細胞全扔了。
他先取了污染液做涂片和生化鑒定。
鑒定結(jié)果是表皮葡萄球菌。
他推測是操作人員在生物安全柜里說話時，飛沫掉進了培養(yǎng)瓶。
富有經(jīng)驗的工藝方面的人，會對你講告知，輕微程度的細菌被污染這種情況，實際上是能夠采用抗生素來進行處理，借此實現(xiàn)挽救的。
但老陳不建議這么做。
因為抗生素處理會改變細胞代謝狀態(tài)，后續(xù)的表達數(shù)據(jù)不可靠。
而且一旦你習(xí)慣了用抗生素，就會放松無菌操作的要求。
所以他直接銷毀了所有受污染的細胞株，重新從主細胞庫復(fù)蘇。
就在同一時刻，他對整個細胞房展開了徹徹底底的清潔，先是運用殺孢子劑去擦拭整個細胞房里的所有臺面，接著擦拭培養(yǎng)箱的內(nèi)壁，然后擦拭離心機的轉(zhuǎn)子，最后擦拭水浴鍋。
培養(yǎng)箱的水盤換成無菌純水，每周更換一次。
生物安全柜的HEPA過濾器也請廠家做了檢漏。
2026年4月25日，當(dāng)所有事情都準(zhǔn)備妥當(dāng)之后，他再度使一瓶工作細胞庫的細胞恢復(fù)了生機。
這次他格外小心，連移液器都換了一套新的。
三天后細胞長滿，活力97%，鏡檢無任何污染跡象。
老陳說，這一個月雖然折騰，但值。
他現(xiàn)在對細胞株的理解，比過去三年加起來都深。
細胞株管理的SOP一定要寫清楚什么？
老陳最后把這段經(jīng)歷寫成了一份內(nèi)部SOP。
他告訴我，SOP里最容易被忽略的是異常處理流程。
大多數(shù)SOP只寫“正常怎么做”，不寫“如果出錯了怎么辦”。
他特意加了幾條：
針對細胞株身份鑒定，每半年會開展一次短串聯(lián)重復(fù)序列檢測，若檢測結(jié)果不通過，那么相關(guān)細胞株將被直接進行銷毀。
細胞房出現(xiàn)的污染事件，得將其記錄下來，要記錄污染發(fā)生的時間，記錄污染的菌種是什么，記錄造成污染的可能原因，還要記錄相應(yīng)的整改措施。
任何細胞株傳代超過30代后，必須重新做穩(wěn)定性測試。
凍存管標(biāo)簽必須用耐液氮的防水標(biāo)簽，手寫標(biāo)簽一律禁止。
他還規(guī)定，每個人只能操作自己負責(zé)的細胞株，不能跨項目操作。
每月，每個人都要進行一回?zé)o菌操作的考核，在顯微鏡下分辨出三種常見的污染菌，即霉菌，酵母菌，還有桿菌。
不合格的暫停細胞房操作權(quán)限，重新培訓(xùn)。
這份SOP在2026年4月28日通過公司審核，正式生效。
上個月我去蘇州找他吃飯，他整個人精神狀態(tài)都不一樣了。
他講當(dāng)下每日在進入細胞房之前，會于門口站立五秒鐘，對自身的手套、口罩、袖口、頭罩予以檢查。
然后推門進去，關(guān)上門，不說話，只干活。
三個月前那批報廢的細胞株，現(xiàn)在想起來還是會心疼。
不過他講，要是沒有那一回的教訓(xùn)，他或許直至如今還會認為細胞株能夠隨意購買、能夠隨意培養(yǎng)就可以了。
有些路，自己不摔一跤，別人說破嘴皮子也沒用。
他最后跟我說了一句話，我覺得特別實在：
拿細胞株這個事兒來說，能用錢搞定的統(tǒng)統(tǒng)都不算啥難題。難題在于那些用錢搞不定的方面，像你的習(xí)慣，再者是你的細心程度，還有你對規(guī)則所抱有的敬畏之心。
如若你同樣在從事細胞株關(guān)聯(lián)的工藝開發(fā)方面的工作，那么建議你回過頭去瞧上一眼你所擁有的細胞庫鑒定報告，以及你所做的傳代記錄，還有你的污染處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序。
別等到數(shù)據(jù)全廢、項目延期才后悔。
那一份SOP，是老陳發(fā)給我的，有需求的朋友，要是可以私信我，那我會轉(zhuǎn)發(fā)給你。
