兔原代細(xì)胞
為什么朋友說兔原代細(xì)胞分離總卡在第一步
我認(rèn)識(shí)老張有五年了，他在一家生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)板塊。
前段時(shí)間他接了個(gè)新項(xiàng)目，需要用到兔原代細(xì)胞做基礎(chǔ)研究。
原本覺得這件事情并不是很難，但是呢，老張接連不斷地折騰了兩星期，然而最終竟然是連一管達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞都沒有獲取到。
他給我撥通電話之際，嗓子已然沙啞，聲稱，“明明是依照標(biāo)準(zhǔn)步驟行進(jìn)，然而細(xì)胞卻并不帖壁”。
2026年3月中旬，我在老張的實(shí)驗(yàn)室見到了他。
桌上擺著幾只新西蘭兔的組織塊，培養(yǎng)箱里幾瓶混濁的培養(yǎng)基。
他指著其中一瓶說：“你看，這已經(jīng)是第四次了，全部污染?！?/p>
我向他詢問具體是怎樣進(jìn)行操作的，老張針對(duì)流程講述了一回，問題于即刻呈現(xiàn)了出來。
兔原代細(xì)胞分離時(shí)最容易忽略的細(xì)節(jié)
老張用的是兔腎臟組織，想分離腎皮質(zhì)原代細(xì)胞。
他第一步就把組織剪得太碎，雖然這樣消化快，但細(xì)胞損傷也大。
我于一旁瞧著他進(jìn)行操作，他所采用的是百分之零點(diǎn)二五的胰酶，其消化時(shí)間被把控在二十分鐘。
實(shí)際上，兔子的組織結(jié)構(gòu)是相對(duì)易于受到損害的，在相關(guān)的學(xué)術(shù)資料當(dāng)中，所給出的建議是采用濃度為0.125%的胰酶與膠原酶相互搭配使用。
老張沒注意這個(gè)差異，結(jié)果每次離心后活細(xì)胞率都不到40%。
2026年3月22日那天，我建議他換一種消化方案。
先將胰酶的濃度把它降低到0.1%，之后再去添加0.5mg/ml的膠原酶IV型，是這樣的操作流程。
消化溫度也從37度降到35度，時(shí)間延長到30分鐘。
老張帶著半信半疑地神情進(jìn)行了一回嘗試，在借助鏡子觀察期間，顯著地察覺到細(xì)胞的狀態(tài)改善了許多。
還有一個(gè)坑是培養(yǎng)基的pH值和滲透壓。
兔原代細(xì)胞對(duì)酸堿度很敏感，市面上通用的DMEM需要調(diào)整。
老張之前直接買成品高糖DMEM，沒測pH直接就用。
我致使他借助pH計(jì)將數(shù)值調(diào)節(jié)到了7.2，把滲透壓把控在大約290 mOsm/kg的范圍之內(nèi)。
這一步改完之后，細(xì)胞貼壁率從不到30%提升到了65%以上。
如何判斷你提取的兔原代細(xì)胞能不能用
老張第一次拿到貼壁細(xì)胞時(shí)特別興奮，但第二天一看又不對(duì)了。
細(xì)胞是長出來了，然而其形態(tài)卻是雜亂無章的，存在著這樣的情況，有的呈現(xiàn)出梭形，有的呈現(xiàn)出多角形。
他問我：“這到底是不是我要的腎小管上皮細(xì)胞？”
我讓他做了個(gè)簡單的鑒定：用CK-18抗體做免疫熒光染色。
結(jié)果是陽性的細(xì)胞不到50%，說明混入了大量成纖維細(xì)胞。
這是兔原代細(xì)胞提取中的常見問題——雜細(xì)胞過多。
老張反思了一下，問題出在組織塊消化后的篩網(wǎng)過濾環(huán)節(jié)。
他所使用的，有著100目規(guī)格的篩網(wǎng)，其孔徑尺寸過大，致使成纖維細(xì)胞，與小管碎片，完全混雜在了一塊兒。
我建議他改用200目和400目兩層篩網(wǎng)依次過濾。
2026年4月3日，老張按照這個(gè)新方案重新做了一遍。
這一回，他耗費(fèi)了比以往多出一個(gè)小時(shí)的時(shí)間，將經(jīng)過消化之后所得到的懸液，先是拿去通過200目的篩網(wǎng)，而后又拿去通過400目的篩網(wǎng)。
400目篩網(wǎng)能截留大多數(shù)成纖維細(xì)胞和間質(zhì)成分。
濾下來的液體再離心，沉淀重懸后接種。
第二天觀察，視野里基本是均一的鵝卵石樣細(xì)胞。
他做了流式鑒定，CK-18陽性率超過了85%。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)三天就飄起來的原因找到了
細(xì)胞被分離出來之后，老張覺得所有事情都圓滿順利了，然而在培養(yǎng)工作開展到了第三天的時(shí)候又出現(xiàn)異常情況。
原本貼得好好的細(xì)胞開始慢慢飄起來，培養(yǎng)基也變黃很快。
他換了新鮮培養(yǎng)基，依然止不住細(xì)胞脫落。
這其實(shí)是很多初學(xué)者容易忽視的環(huán)節(jié)——換液時(shí)機(jī)不對(duì)。
2026年4月10日，我陪他一起做了個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
第一組在種板后24小時(shí)就換液，第二組等到48小時(shí)才換。
結(jié)果24小時(shí)換液的那組，細(xì)胞飄了將近一半。
因?yàn)橥迷?xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)需要時(shí)間沉積。
過早換液會(huì)把剛鋪展的基質(zhì)沖掉，細(xì)胞自然待不住。
老張后來改成接種后48小時(shí)內(nèi)不動(dòng)培養(yǎng)瓶，只輕輕補(bǔ)加培養(yǎng)基。
三天后首次半量換液，之后每兩天換一次，每次只換一半。
飄起來的細(xì)胞大大減少，到了第七天已經(jīng)長到80%匯合度。
他另外發(fā)覺兔原代細(xì)胞并不需要常常觀察，而每一次將其從培養(yǎng)箱拿出來的時(shí)候，都會(huì)對(duì)溫度造成擾動(dòng)。
后來他索性把培養(yǎng)瓶放進(jìn)三氣培養(yǎng)箱，氧濃度調(diào)到5%。
這樣一來，細(xì)胞的長勢更穩(wěn)定了。
做兔原代細(xì)胞一定要避開這幾種試劑
老張以前養(yǎng)細(xì)胞不挑試劑，實(shí)驗(yàn)室有什么用什么。
但兔原代細(xì)胞對(duì)某些添加劑特別敏感，比如抗生素。
他之前一直加青霉素-鏈霉素雙抗，濃度是100U/ml。
某一回，他察覺到添加了雙抗的細(xì)胞生長速度遲緩，在將其換成無抗培養(yǎng)基之后，細(xì)胞生長狀況恢復(fù)了不少。
后來查資料才知道，兔細(xì)胞對(duì)青霉素的耐受度比鼠細(xì)胞低。
2026年4月，處于中旬時(shí)段，老張?zhí)匾馊ゲ少徚藥讟游锲?，這些物品是適合兔原代細(xì)胞的。
胎牛血清換成特級(jí)款，并且用了透析過的血清。
加了EGF的生長因子，加了胰島素的生長因子，其濃度分別被控制在10ng/ml，其濃度分別被控制在5μg/ml。
消化時(shí)用的TrypLE替代了胰酶，對(duì)細(xì)胞膜損傷更小。
這些改動(dòng)看起來不起眼，但累計(jì)效果特別明顯。
他還在培養(yǎng)瓶底預(yù)鋪了I型膠原，幫助細(xì)胞更快貼壁。
采用了這些舉措以后，兔源的原代細(xì)胞，從進(jìn)行提取開始，一直到實(shí)現(xiàn)傳代，所經(jīng)歷的時(shí)間，減少了整整兩天。
老張說早知道這些細(xì)節(jié)，之前那三周就不至于白折騰。
兔原代細(xì)胞污染后別急著扔 先做這一步
做原代培養(yǎng)最怕污染，老張也中過招。
有一次培養(yǎng)皿里出現(xiàn)了絮狀物，培養(yǎng)基變渾濁。
他本打算全部扔掉，我勸他先做一下鑒別。
取一點(diǎn)培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色后鏡下看見的是桿菌。
這提示可能是操作時(shí)帶進(jìn)去的環(huán)境細(xì)菌。
2026年4月20日，老張遇到了一次真菌污染。
培養(yǎng)基沒變渾，但出現(xiàn)了白色菌落，還有一絲霉味。
他這回變得機(jī)靈了，并非將所有的都舍棄掉，而是把那處在污染孔旁邊的狀態(tài)良好的細(xì)胞挽救出來了。
用加了25μg/ml兩性霉素B的洗滌液洗了三遍。
再轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶里，加高濃度抗真菌藥維持兩天。
最后竟然救回了不到20%的細(xì)胞，足夠重新擴(kuò)增。
不過老張也提醒，如果是支原體污染，肉眼根本看不出。
他后來養(yǎng)成了每個(gè)月用PCR檢測一次支原體的習(xí)慣。
每次提取兔原代細(xì)胞前，所有試劑都要做無菌驗(yàn)證。
操作臺(tái)里的紫外燈提前開夠40分鐘，新風(fēng)系統(tǒng)保持正壓。
這些看似繁瑣的步驟，其實(shí)能省下后面大量的補(bǔ)救時(shí)間。
老張現(xiàn)在做兔原代細(xì)胞已經(jīng)很順手了。
上個(gè)月他分離了兔肝細(xì)胞，一次成功，活細(xì)胞率91%。
他說最大的收獲不是學(xué)會(huì)了一門技術(shù)，而是明白了細(xì)節(jié)決定成敗。
從組織進(jìn)行取材開始，到實(shí)施消化過濾為止，從配置培養(yǎng)基的比例，到把握換液的時(shí)機(jī)，每一個(gè)步驟都不能著急。
如果你也在做兔原代細(xì)胞，不妨對(duì)照著檢查一下自己的流程。
也許調(diào)整一兩個(gè)參數(shù)，結(jié)果就會(huì)完全不同。
