我知曉有一位友人，這人被稱作老張，其于長三角地區(qū)的一家從事生物技術(shù)的公司里開展研發(fā)工作。他所負(fù)責(zé)的關(guān)鍵事務(wù)便是與各式各類的細(xì)胞進(jìn)行接觸交流，特別是原代細(xì)胞。上個(gè)月之際，我前往蘇州去尋覓他，彼時(shí)他才剛剛完成了一批針對(duì)小鼠肝原代細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)，然而最終的結(jié)果并不太盡如人意，他正面對(duì)著顯微鏡不停地唉聲嘆氣呢。
老張進(jìn)入行業(yè)五年，頭三年從事的是細(xì)胞系工作，包括傳代、凍存以及復(fù)蘇，就算閉著雙眼都能夠完成。然而兩年之前公司進(jìn)行轉(zhuǎn)型，開始著手做藥物篩選模型，這需要運(yùn)用到更貼近體內(nèi)真實(shí)狀況的原代細(xì)胞。自那時(shí)起，他的順?biāo)烊兆颖阈娼Y(jié)束了。
為什么原代細(xì)胞總是養(yǎng)不好？
老張頭一回試著去分離小鼠腸上皮原代之細(xì)胞，依照文獻(xiàn)所給之步驟，先是進(jìn)行消化，接著予以過濾，隨后開展離心，最后實(shí)施鋪板。到第二天一看時(shí)，貼壁的那些細(xì)胞稀稀拉拉的，并且存在著好多呈圓形的已然死掉的細(xì)胞。那時(shí)他心里想，是不是酶去進(jìn)行消化的時(shí)間太久了呢？
后來連續(xù)進(jìn)行了三批，其中每一次的活率均處于百分之六十這個(gè)數(shù)值以下，身為領(lǐng)導(dǎo)尋他談話，表明如此這般持續(xù)下去項(xiàng)目進(jìn)度將會(huì)被拖延，老張承受的壓力極大，在那段時(shí)期天天睡眠狀況欠佳，于夜里還返回實(shí)驗(yàn)室查看培養(yǎng)箱的溫度以及二氧化碳濃度。
在2025年的那個(gè)秋天， 他前往杭州那邊， 參與了一場(chǎng)細(xì)胞生物學(xué)范疇的小型研討會(huì)， 在其間碰到了一位同行， 這位同行于浙大某個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展原代細(xì)胞培養(yǎng)工作長達(dá)六年時(shí)間， 在聽聞他所講述的困境之后， 僅僅說了這么一句話， “你依照細(xì)胞系的方法去培養(yǎng)原代， 能把它養(yǎng)好才怪呢?！?。
老張這才察覺到，原代細(xì)胞以及永生化的細(xì)胞系，完完全全是兩個(gè)不同的范疇。細(xì)胞系相對(duì)耐折騰，營養(yǎng)稍微差點(diǎn)、消化稍微過一點(diǎn)，依舊能夠生長。然而原代細(xì)胞卻極其嬌弱珍貴，分離的時(shí)候每一次操作步驟都會(huì)對(duì)后續(xù)的狀態(tài)產(chǎn)生效應(yīng)了。
原代細(xì)胞分離的關(guān)鍵步驟有哪些？
老張回來后，重新梳理了整個(gè)流程，他發(fā)現(xiàn)在2025年11月的一個(gè)下午，他做了一次小鼠腎原代細(xì)胞分離，此次是照著新方案進(jìn)行的，在消化這一步他用了低溫胰酶，消化時(shí)間縮減到十五分鐘，并且在終止時(shí)用了含血清的培養(yǎng)液輕柔中和。
他留意到一個(gè)細(xì)節(jié)，那就是離心力，此前他運(yùn)用的是三百克五分鐘，同行告知他，原代細(xì)胞對(duì)于離心力較為敏感，最好將其降低到兩百克，并且把時(shí)間延長至八分鐘，果真如此，此次離心之后的細(xì)胞沉淀顯得更加松散，重懸之后細(xì)胞碎片顯著減少。
板鋪好后，他摒棄了平常習(xí)用的培養(yǎng)皿，動(dòng)用的是包被了多聚賴氨酸的板子，第二天瞅了瞅，貼壁率由先前的百分之四十提升到，百分之七十五。老張講他那時(shí)，險(xiǎn)些會(huì)在實(shí)驗(yàn)室里叫嚷出聲來。
然而問題并未就此終結(jié)。到了第三天，他著手進(jìn)行換液操作，借助顯微鏡展開觀察，察覺到部分細(xì)胞呈現(xiàn)出鋪展不佳的狀況，并且有些區(qū)域出現(xiàn)了空泡現(xiàn)象。之后，他拍攝了照片并發(fā)送至行業(yè)群里，有人指出或許是培養(yǎng)液的成分存在問題。原代細(xì)胞所需要的生長因子以及激素配比，與細(xì)胞系全然不同。
原代細(xì)胞污染了怎么辦？
直至2026年1月之時(shí)，老張已然能夠穩(wěn)定地分離出那些活率超過百分之八十的原代細(xì)胞，然而新到的麻煩隨即出現(xiàn)，此之謂污染，他存有一批豬脂肪原代細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)至第五日之際，培養(yǎng)液變得漸趨渾濁，在顯微鏡之下可見一些體積微小的桿狀物體正在移動(dòng)，經(jīng)判斷為細(xì)菌污染，于是整批細(xì)胞宣告報(bào)廢。
她對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)都進(jìn)行了排查，超凈臺(tái)里面的高效過濾器已經(jīng)使用了十個(gè)月，其效率或許出現(xiàn)了下降情況，吸管于無菌操作期間不經(jīng)意間碰到了瓶口的外壁，另外存在一個(gè)極易被忽視的情況，亦或是原代細(xì)胞分離的進(jìn)程當(dāng)中，組織塊自身攜帶有細(xì)菌，即是操作得再怎么規(guī)范，要是來源組織沒處理妥當(dāng)?shù)脑?，污染的風(fēng)險(xiǎn)依舊是非常高的。
老張采用的辦法是，于用于分離的磷酸鹽緩沖液之中，添加雙倍濃度的抗生素以及抗真菌劑，與此同時(shí)，將組織塊首先用含有碘伏的溶液浸泡三十秒，接著再使用無菌生理鹽水沖洗五次。此步驟使得他每次分離時(shí)大約增加了十分鐘，然而污染率卻從百分之三十降低到了百分之五。
他還養(yǎng)成了這么一個(gè)習(xí)慣，每次分離之后的前三小時(shí)，要去取一次培養(yǎng)液做無菌涂片，第一天，同樣要去取一次培養(yǎng)液做無菌涂片，第三天，還是要去取一次培養(yǎng)液做無菌涂片。如此這般做手續(xù)雖然繁雜麻煩，然而卻能夠在早期就發(fā)現(xiàn)污染情況，進(jìn)而及時(shí)地將其棄掉，以此來避免污染整個(gè)培養(yǎng)箱。
如何提高原代細(xì)胞的貼壁率？
今年3月，老張著手挑戰(zhàn)在皮膚原代細(xì)胞里，將成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，這更為困難，原因在于兩種細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)條件的要求存在差異。
他記起先前于文獻(xiàn)里瞅見的一項(xiàng)技巧，運(yùn)用低血清培養(yǎng)液先行鋪板一小時(shí)，以使成纖維細(xì)胞率先貼壁，接著緩緩吸走未貼壁的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)至另一個(gè)包被了膠原的培養(yǎng)皿內(nèi)，如此這般角質(zhì)形成細(xì)胞便可更優(yōu)地附著。
他做了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，地點(diǎn)是上海浦東的一個(gè)共享實(shí)驗(yàn)室，時(shí)間為2026年3月15日下午兩點(diǎn)，其中。第一遍操作過后，成纖維細(xì)胞的貼壁率達(dá)到百分之九十，并且角質(zhì)形成細(xì)胞在二次貼壁后同樣達(dá)到了百分之七十，就連老張都說在實(shí)驗(yàn)記錄本上他那會(huì)兒特意畫了個(gè)笑臉。
然而，真正致使他感到得意的情形，乃是成功解決了原代細(xì)胞所存在的“老化”這一問題。眾多的原代細(xì)胞，在于體外進(jìn)行培養(yǎng)兩至三代之后，便會(huì)開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，其形態(tài)出現(xiàn)變大的狀況，繼而增殖也陷入停滯狀態(tài)。他察覺到，這一問題與在進(jìn)行消化傳代操作的時(shí)候，胰酶的濃度存在著極大的關(guān)聯(lián)。針對(duì)那些格外敏感的原代細(xì)胞，他將胰酶稀釋至常規(guī)濃度的四分之一，并且放置于冰上進(jìn)行預(yù)冷處理，在消化過程中，每隔兩分鐘便輕輕拍打培養(yǎng)皿，一旦觀察到細(xì)胞變?yōu)閳A形，便即刻予以終止。
如此去做之后，他的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞能夠穩(wěn)定地傳至第五代，其狀態(tài)依舊良好。隔壁實(shí)驗(yàn)室的同行目睹此番情形后，特意前來找他求取經(jīng)驗(yàn)。
原代細(xì)胞凍存有哪些注意事項(xiàng)？
今年4月，公司有一批已分離好的大鼠心肌原代細(xì)胞，需要進(jìn)行凍存，從而用來以備后續(xù)使用。老張以往凍存細(xì)胞系時(shí)，直接采用百分之十的二甲基亞砜加胎牛血清，將其放置到程序降溫盒里過夜，第二天再轉(zhuǎn)移至液氮中。然而原代細(xì)胞凍存后再復(fù)蘇，其活率常常會(huì)下降一大截。
眾多資料被他查閱，最終采用改良方案：凍存液添加ROCK抑制劑Y - 27632，此抑制劑可抑制細(xì)胞凍融時(shí)離散化死亡，他還將降溫速度控制更慢，先于零下二十度放置三十分鐘，再轉(zhuǎn)至零下八十度過夜，次日才投入液氮。
距離復(fù)蘇這批細(xì)胞過去了一個(gè)月，他對(duì)其實(shí)施了臺(tái)盼藍(lán)染色操作，得出活率為百分之八十五的結(jié)果。在他所在的公司里，這樣的結(jié)果算是最為出色的了。于周會(huì)上，部門經(jīng)理特意提及了此事，要求其他同事效法他。
老張跟我講，他做了兩年原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，最大的感受可提煉為八個(gè)字，即慢就是快，細(xì)就是穩(wěn)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程里，從采用的動(dòng)物品種、周齡，到解剖時(shí)候的力度、溫度，再到培養(yǎng)基的pH值、滲透壓，只要其中任何一個(gè)變量出現(xiàn)偏差，那么最終結(jié)果就會(huì)偏離預(yù)期。
在他的辦公室之中，貼著一張表格存在著，表格上面列著二十多種原代細(xì)胞的分離參數(shù)。從2025年開始直至2026年，他前前后后記錄了四十七次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。那些失敗的經(jīng)驗(yàn)，像胰酶的濃度過高致使細(xì)胞膜破裂了，離心力太大導(dǎo)致細(xì)胞核已經(jīng)被擠出來了，培養(yǎng)液的溫度太低導(dǎo)致細(xì)胞休克了——這些如今都變成了他的知識(shí)庫。
上周周末的時(shí)候，他給我打了電話，告知我他剛剛幫一家處于初創(chuàng)階段的公司，解決了腸道類器官開展培養(yǎng)的相關(guān)問題。那家公司此前也是在原代細(xì)胞進(jìn)行分離這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)上遭遇了阻礙，在采用了他所提供的方案以后，類器官形成的效率實(shí)現(xiàn)了翻倍增長。老張講現(xiàn)在領(lǐng)悟到了一個(gè)道理，那就是原代細(xì)胞這個(gè)事物，不存在捷徑可走，唯有將每一個(gè)細(xì)節(jié)都仔細(xì)鉆研到極致的程度。
要是你也正從事同樣的工作，不妨?xí)呵彝Ｏ?，將分離步驟自始至終書寫一遍，標(biāo)明每個(gè)環(huán)節(jié)存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，隨后，針對(duì)你手中特定的細(xì)胞類型，去查找起碼十篇近五年的文獻(xiàn)，把他人優(yōu)化好的條件羅列出來，逐一進(jìn)行嘗試，別害怕慢，別畏懼失敗，每一批廢棄掉的細(xì)胞，只要你記錄了當(dāng)時(shí)的環(huán)境參數(shù)，便都是具備價(jià)值的。
愿老張所歷經(jīng)之事對(duì)你存有一定助益，身為從事原代細(xì)胞培養(yǎng)之友人，歡迎將此篇內(nèi)容予以收藏，往后遭遇相似問題之際翻出來予以對(duì)照，亦請(qǐng)轉(zhuǎn)發(fā)給實(shí)驗(yàn)室中此刻正遭受原代細(xì)胞困擾的同仁，或許能夠助力他們少走半年的曲折之路。
