上個(gè)月份，和一位老同學(xué)一塊兒吃飯，談到了他近來的工作情況。這位老同學(xué)本科是學(xué)習(xí)生物專業(yè)的，于一家生物技術(shù)公司從事研發(fā)工作，專門針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)這一領(lǐng)域進(jìn)行負(fù)責(zé)。他講上半年始終在和兔原代細(xì)胞作斗爭(zhēng)，期間走過了諸多路徑曲折的彎路，后來終于是尋找到了其中的訣竅。這篇文章將他的經(jīng)歷予以撰寫呈現(xiàn)，期望能夠給同樣開展這類工作的朋友們提供一些思考方向。內(nèi)容皆是他真切親身經(jīng)歷過的失誤教訓(xùn)以及總結(jié)歸納出來的辦法手段，我認(rèn)為對(duì)于剛剛接觸這個(gè)領(lǐng)域的人員來說應(yīng)該是頗具助益的。
叫張磊他，于蘇州一家生物科技公司工作三年有余，該公司聚焦藥物篩選相關(guān)服務(wù)，時(shí)常需借助各類原代細(xì)胞構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，今年春?jié)過后不久，老板承接新項(xiàng)目，此項(xiàng)目需大量兔原代細(xì)胞用于測(cè)試，張磊先前飼養(yǎng)過小鼠細(xì)胞，自覺差別不算大，隨之主動(dòng)承攬下此項(xiàng)工作。
兔原代細(xì)胞分離有訣竅嗎
究竟是實(shí)際著手操作之后才清楚，兔原代細(xì)胞相較于他原本預(yù)想起來是更具難度去處理的。在2025年3月上旬，他依據(jù)常規(guī)方式，去從兔子的組織當(dāng)中分離細(xì)胞。首次所開展的操作是針對(duì)兔原代心肌細(xì)胞，采用的是膠原酶消化法。然而結(jié)果卻是，已經(jīng)消化了將近兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間，細(xì)胞依舊沒有怎么脫落下來。他略微有些焦急，于是又添加了一些酶進(jìn)去，從而繼續(xù)進(jìn)行消化。等到細(xì)胞最終脫落下來之后，查看其活率，竟然連百分之六十都達(dá)不到。
彼時(shí)他自覺興許是酶存問題，遂更換多家廠商的膠原酶來試驗(yàn)。部分膠原酶消化力度過猛，致使細(xì)胞破碎成一片； 部分膠原酶消化力度過弱，導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)塊全然無法打散。如此反復(fù)折騰將近兩周時(shí)間，細(xì)胞活率始終于及格線附近徘徊。那段日子他下班頗為晚，有時(shí)晚上十點(diǎn)多還身處實(shí)驗(yàn)室觀察細(xì)胞。
后來呀，他翻閱了好多文獻(xiàn)，還向以前實(shí)驗(yàn)室的師兄進(jìn)行了詢問，這才發(fā)覺那兔原代細(xì)胞頗為嬌氣，對(duì)于酶是相當(dāng)敏感的。他之前所用的酶濃度偏高，而且消化時(shí)間也較為長。經(jīng)過調(diào)整以后，將酶濃度降低到原來的三分之二，把消化時(shí)間控制在大概四十分鐘，分兩次進(jìn)行消化。如此這般，細(xì)胞活率一下子提升到百分之八十五以上了。
兔原代細(xì)胞分離時(shí)溫度要控好
還有個(gè)他一開始沒留意到的細(xì)微之處，那便是溫度。在2025年3月中旬的時(shí)候，他有一回進(jìn)行兔原代肝細(xì)胞操作，消化的全過程都是在冰面上開展的。然而細(xì)胞無論如何都難以被消化下來，效率顯著很低。過后查閱資料才曉得，低溫會(huì)致使酶的活性大幅降低。隨后他將溫度調(diào)節(jié)到三十七度，在恒溫水浴搖床當(dāng)中做消化，效率明顯提升了。
兔原代細(xì)胞污染怎么防
才把細(xì)胞活率方面那個(gè)問題給處理好，緊接著新的棘手狀況就冒出來了。在2025年3月月底的時(shí)候，他培育了一些兔原代成纖維細(xì)胞，到第三天去查看時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變得渾濁不清了。通過顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)里面全都是細(xì)菌。他當(dāng)時(shí)內(nèi)心挺失落的，畢竟操作的時(shí)候已經(jīng)格外小心謹(jǐn)慎了，超凈臺(tái)的紫外線也已經(jīng)照射過了，而且各種器具也都進(jìn)行過滅菌處理了。
他進(jìn)行了一番排查，認(rèn)為問題或許出在組織的來源之處。兔子組織是從外邊采購回來的，其表面難以避免地會(huì)帶有一些細(xì)菌。他先前僅僅只是簡(jiǎn)單地使用酒精浸泡了一下，有可能并未做到徹底滅菌。隨后他對(duì)方法予以改進(jìn)，在無菌的條件之下，運(yùn)用含有雙抗的緩沖液反復(fù)清洗組織，起碼要清洗五到六遍，將組織表面的污染物盡可能地去除掉。
兔原代細(xì)胞加雙抗有用嗎
他特地嘗試驗(yàn)證雙抗的成效 ，將同一批組織劃分成兩份 ，一份運(yùn)用含有雙抗的液體進(jìn)行清洗 ，另一份運(yùn)用不含有雙抗的液體進(jìn)行清洗。結(jié)果顯示 ，清洗得較為徹底的那一批 ，歷經(jīng)一周培養(yǎng)未曾遭受污染 ；未添加雙抗的那一批 ，在第三天便開始滋生細(xì)菌了。所以 ，他提出建議 ，在兔原代細(xì)胞分離進(jìn)程里面 ，最好添加雙抗 ，起碼在前期培養(yǎng)階段使用一段時(shí)期 ，待細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定之后再予以撤除。
兔原代細(xì)胞活率低咋辦
控制住了污染的那問題，可是活率卻是不大那么穩(wěn)定的狀況。有的一批次是能夠被做出來的，而有的一批次卻不可以。在2025年4月初的時(shí)間段，他接連著去做了三批兔原代腎小管上皮細(xì)胞，然而其中有兩批操作是失敗的情形。細(xì)胞狀況。細(xì)胞才剛貼壁的那個(gè)時(shí)刻觀看著是還好挺好的樣子，但是過了兩天就開始出現(xiàn)漂的情況，就算進(jìn)行換液操作也挽救不回來這種局面。
他開始疑惑，這是不是培養(yǎng)基方面的問題呢？兔原代細(xì)胞與細(xì)胞系不同，其對(duì)營養(yǎng)的需求更高些。他以往使用的乃是普通的 DMEM，還添加了百分之十的胎牛血清。過后查閱資料得知，部分兔原代細(xì)胞需要添加一些特別的因子，像表皮生長因子、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白等這些。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)基怎么配
他依據(jù)文獻(xiàn)之中的配方，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)增添了表皮生長因子、氫化可的松、胰島素這些成分，調(diào)整過后，細(xì)胞的貼壁率以及增殖速度均好了許多，他亦留意到，兔原代細(xì)胞較為喜好偏酸一些的環(huán)境，當(dāng)培養(yǎng)基的顏色略微偏橙紅之際，細(xì)胞的狀態(tài)最佳。
再者，換液的頻率同樣不可以過于頻繁。兔原代細(xì)胞在剛剛被分離出來之際是極為脆弱的，在最初的三天時(shí)間里最好是盡可能地不進(jìn)行換液操作。他先前因?yàn)閼峙麓x廢物出現(xiàn)積累的情況，在第二天就去實(shí)施換液，結(jié)果卻將細(xì)胞折騰致死。之后改為前三天不換液，到了第四天進(jìn)行半量換液一次，細(xì)胞便生長得十分穩(wěn)定。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)多久能用
經(jīng)由之前那些調(diào)整，直至2025年4月中旬時(shí)，張磊最終做出了一批令人滿意的兔原代細(xì)胞，那次所做的乃是兔原代軟骨細(xì)胞，從進(jìn)行分離一直到完成鋪板，整個(gè)進(jìn)程都頗為順?biāo)?，?xì)胞貼壁速度快，形態(tài)亦是良好，呈現(xiàn)出典型的鋪路石狀模樣，他運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)染色來查看活率，結(jié)果超過百分之九十。
一批細(xì)胞，他養(yǎng)到了那一天，即第七天，其狀態(tài)，依舊很好。他帶著細(xì)胞，拿到何處去了，被拿去制作了一場(chǎng)藥物處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，那叫一個(gè)漂亮，跟文獻(xiàn)里所報(bào)道的結(jié)果，基本上是吻合的。老板看了那份報(bào)告，也是頗為滿意的，說往后后面這個(gè)項(xiàng)目的主力細(xì)胞來源，就依照這一流程來實(shí)施。
從那之后，他再度去做兔原代細(xì)胞時(shí)就順暢許多了。進(jìn)行分離，開展培養(yǎng)，實(shí)施傳代，每個(gè)環(huán)節(jié)都構(gòu)建起了固定的操作習(xí)慣。他講實(shí)際上沒有什么高深莫測(cè)的技巧，僅僅是把每一步都做到盡善盡美，留意細(xì)節(jié)。像消化之時(shí)頻繁去觀察，培養(yǎng)基預(yù)先進(jìn)行預(yù)熱，操作動(dòng)作稍微輕柔一點(diǎn)，這些看似毫不起眼的小事情，對(duì)于兔原代細(xì)胞而言或許就決定了成功或失敗。
他如今每周都要去做一至兩批的兔原代細(xì)胞，其成功率穩(wěn)穩(wěn)地保持在百分之九十以上。偶爾，新入職的同事會(huì)向他詢問訣竅，這時(shí)他就會(huì)把先前那些經(jīng)驗(yàn)講述一番。他認(rèn)為做原代細(xì)胞這件事情，著急不得，粗糙不得，必須耐著性子一點(diǎn)一點(diǎn)地去摸索。
倘若你同樣正著手進(jìn)行兔原代細(xì)胞相關(guān)工作，不妨去瞧瞧他所經(jīng)歷的這些曲折路徑。其中，消化環(huán)節(jié)、污染環(huán)節(jié)以及培養(yǎng)基環(huán)節(jié)，這三個(gè)方面是最易于產(chǎn)生問題的。要把控好溫度，要將滅菌工作做得以徹底，要把培養(yǎng)基成分搭配得恰到好處，如此一來，大概率能夠少犯下許多錯(cuò)誤。期望他的經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)δ阌兴妗?/p>
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