搞科研的都懂，ELISA試劑盒看似簡單，用起來卻常出問題
我有個朋友叫老趙，在上海浦東一家生物技術公司做研發(fā)主管。
他們所在的團隊，主要從事細胞因子檢測方面的工作，而ELISA試劑盒，乃是在日常工作過程中，與之打交道最為頻繁的工具。
上個月，我前往張江，去找他一塊兒吃飯，他一坐下，便開始嘆氣，聲稱最近被那個試劑盒折騰得相當夠嗆。
有個人和我轉述，別看ELISA的實驗步驟就是僅有幾項步驟，可實際實際操作進行這項實驗時，結果會出現漂移現象，背景會過高，標曲其線的線性也很差，各種各樣麻煩性的問題會交替不斷出現。
我問他到底怎么回事，他就給我講了近三個月踩坑的經歷。
才聽完，我便察覺到，這般的坑，實質上幾乎是每一個在從事科研相關工作的人都極有可能會碰到的，鑒于此，我隨之將他所經歷的故事予以整理，期望著以此可為大家?guī)硪欢ǖ闹?，起到一定的作用?/p>
同一個項目，前后兩批試劑盒結果竟然對不上
老趙所在的公司，在去年的時候，承接了某一項特定的委托，這項委托的內容是，要對幾十份樣本當中的三種炎癥因子進行檢測。
開始之時，他所持用的乃是實驗室平常常用的某一進口品牌，于前面的兩個批次開展操作之后，所獲取的數據呈現出極為美觀的態(tài)勢，CV值均處于百分之八這個范圍以內。
在今年的三月份，他們對一批樣本進行了補充，隨后，又訂購了與之前貨號相同的新一批次的試劑盒。
標曲跑出來的結果是，R平方僅僅為0.92，然而之前的批次卻能夠達成0.99以上的數值。
更奇怪的是，質控品的實測值比標稱值低了將近百分之四十。
老趙覺得這屬于操作范疇的問題，于是讓兩個進行實驗的人員分別各自去再次做一次，然而最終得到的結果居然完全一樣。
他與廠家的技術支撐取得聯系，對方聲稱批次之間存在正常波動，給出了重新擬合標曲的建議。
在進行重新擬合操作之后，樣本檢測所得到的值，相較于歷史數據降低了，降低的幅度接近一半，如此一來，整個項目所呈現出的趨勢，就全都無法對上了。
科研ELISA試劑盒批次差異大怎么辦
老趙著手對這個問題展開認真的研究，他翻閱查看了過去兩年的有關實驗的記錄，發(fā)現在那當中那個品牌實際上一直存在著批次方面的波動情況，只是在這之前這種狀況并沒有像現在這樣嚴重。
他通過上網去查找資料，并且針對同行詢問了一圈，結果發(fā)現批次差異乃是ELISA試劑盒所存在的普遍的問題。
起到關鍵作用的原因在于，試劑盒當中存有的抗體對屬于生物來源，檢測蛋白是生物來源，酶結合物同樣是生物來源，而且不同批次在進行生產時的過程很難達成完全一樣的狀態(tài)。
有些廠家質控標準比較松，批間差允許到百分之十五甚至更高。
老趙講，之前他從來沒有專門去留意過批間差這個參數，一直認為大品牌理應是穩(wěn)定的。
那批存在問題的試劑盒的質檢報告被他翻了出來，他從中發(fā)現，批間差所寫的數值是百分之十二 ，然而，之前使用起來狀況良好的批次的批間差卻是百分之六。
差了整整一倍，結果自然對不上。
這時他才弄明白，挑選試劑盒，不可以僅僅只看品牌以及靈敏度，而批間差，方是展開長期實驗能夠重復的關鍵所在。
如何判斷ELISA試劑盒質量，不能只看說明書
正當五月中旬的時候，老趙作了一個決定，那就是去嘗試更換一個品牌。他吩咐采購的時候，同時找來了三家具備供應能力的機構，從那里拿回了五種不一樣品牌的，用于科學研究方面的ELISA試劑盒，以此來進行相互之間的對比。
今次他變得機靈了，并非僅僅瞧說明書里所講的靈敏度范疇，卻是著重去看那幾個關鍵指標。
首先是關于標曲的線性范圍，其一，有著這樣的要求，其二，R平方必須處于不低于0.995的之上狀態(tài)，其三，以及最高點與最低點之間得存在足夠寬間距的動態(tài)區(qū)間。
第二點所涉及的是回收率，采用樣本基質加標的方式，此情形下，測定值與理論值之間的偏差，必須處于正負百分之十的范圍以內。
首先是第三點，關乎稀釋線性，要將高濃度的樣本，去進行梯度稀釋操作，而后查看檢測值，是否能夠呈現成比例下降的情況。
排在第四的是批內以及批間精密度，批內CV小于百分之八且批間CV小于百分之十二才被認定為合格。
他花了兩周時間，用同一批樣本同時跑這五種試劑盒。
有意思的是結果，有兩個數據穩(wěn)定的小品牌，而某個試劑盒表現一般的大品牌。
老趙說，這說明不能迷信知名度，自己動手做驗證才最可靠。
科研ELISA試劑盒怎么選，他總結出三條經驗
在六月初的時候，老趙確定了新的試劑盒供應商，他挑選的是那款在驗證期間表現最為出色的品牌，它的批間差僅僅只有百分之五，其標曲R平方穩(wěn)穩(wěn)地保持在0.997以上。
新品試劑盒抵達之后，彼再度對那批存有問題的樣本了進行操作，所測數值同長久以來得出的數據高度相符，老板見此深感稱心。
自那之后，老趙于團隊之中訂立了一項規(guī)矩，每一款新貨號的科研 ELISA 試劑盒到貨之際，都必定要先開展內部驗證，而后方可用于正式樣本。
要進行的驗證內容當中，涵蓋標的曲線性，還有質控品的回收率，以及至少兩個樣本的稀釋之后所呈現的線性。
他要求采購，與供應商進行溝通，每次發(fā)貨之際，提供相同批次的質檢報告，還要保留留樣，以便在可疑之時用于復測。
老趙跟我講，從事科研工作的人極易犯下的錯誤，乃是假定試劑盒不存在問題。
實際上，試劑盒自身乃是一個繁雜的檢測體系，任何一個環(huán)節(jié)倘若出現問題，便會致使數據出現失真的狀況。
他所擁有的經驗存在三條，其一，在挑選試劑盒這個行為當中，優(yōu)先去查看批間差以及批內差的情況，而并非僅僅只是關注靈敏度這一方面；其二，針對每一批新的盒子，都一定要由自己來進行驗證的操作；其三，一旦發(fā)現出現異常的狀況，馬上就要停止實驗，而不要通過強行湊合數據的方式來處理。
用對方法，普通的科研ELISA試劑盒也能跑出好數據
老趙呀，還給我分享了一項小技藝呢。他們那個實驗室以往洗板的時候用的那個物件是自動洗板機，參數設定好了之后就處于靜止不動的狀態(tài)了。
之后，他察覺到，各個不同品牌的試劑盒，在抗體結合強度方面存在差異，進而洗板程序是需要略微進行調節(jié)的。
比如新換的這個品牌，說明書建議洗五次，每次浸泡三十秒。
他進行嘗試之后，發(fā)覺背景依舊是偏高的狀態(tài)，于是將浸泡時間予以延長，使之達到六十秒，隨后背景值馬上就降了下來。
此外，孵化時的溫度這個因素非常緊要，老趙特意於可以保持恒定溫度的箱子內側放入了用于測量溫度的儀器，由此察覺到實際的溫度情況相較于預先設定的數值低了零點五度。
別看這零點五度，標曲的最高點OD值直接掉了零點三。
他校正溫度之后，標曲的斜率恢復了正常。
這些微小的細節(jié)加以表明，科研ELISA試劑盒自身并非不好，然而操作習慣以及儀器狀態(tài)務必要跟得上。
現在，老趙每次在實驗之前，都會使用溫度計去校準孵育的環(huán)境，會運用移液器校準儀來檢查移液的精度，并且，一定會定期去清洗洗板機的針頭。
這些看似繁瑣的步驟，實際上保證了結果的穩(wěn)定。
別怕踩坑，踩過之后才能真正用好科研ELISA試劑盒
對于老趙的經歷，我感觸頗深。有許多人認為，ELISA實驗屬于基礎操作，無需耗費過多心思。
但真正做過幾百塊板子的人都知道，試劑盒的坑無處不在。
不同批次間存在的差異，儲存時條件發(fā)生的變化，乃至運輸過程里溫度出現的波動，均有可能對最終的數據產生影響。
老趙講，他如今反倒感激那次踩坑，緣由那促使他系統(tǒng)地學習鑒定診斷試劑盒與免疫吸附測定試劑盒質量評估辦法。
當前，他所在團隊的數據重復性情況，于同行范圍之內，是屬于頗為良好的那種，就連與之合作的一方，都贊譽他們所取得的結果堅實可靠。
他以開玩笑的方式講道，每一款科研ELISA試劑盒都是一匹不羈的野馬，你必須清楚該如何去馴服它。
要是你同樣正為試劑盒的穩(wěn)定性而發(fā)愁，那不妨依照老趙的做法，親自動手來展開一輪對比驗證。
可能一開始會多花些時間，但長期來看，能省下無數返工的精力。
渴望，此真切的事跡，于你存有助益，致使每一回的ELISA實驗，皆能夠得出美觀的數據。
