一、從一次失敗的擴(kuò)增說起
上個月中旬的時候，我前去拜訪了一位老朋友，這位老朋友是老李，他在一家生物技術(shù)公司工作，在這家公司里他負(fù)責(zé)分子檢測產(chǎn)品的研發(fā)。
說到最近所開展的工作，老李不禁發(fā)出一聲嘆息，表明在三月初時那一批樣品的PCR擴(kuò)增之后所得到的結(jié)果，全都成為了無效的狀態(tài)，最終被判定作廢了。
那時候，我略微感到有些意外，老李于這一行業(yè)歷經(jīng)摸爬滾打長達(dá)七八年之久，其手上所具備的功夫向來十分穩(wěn)健，為何竟會出現(xiàn)這般批量的失誤呢？
他搖搖頭，說問題不在操作上，而是試劑出了狀況。
那一周之內(nèi)，他接連做了三次重復(fù)的實驗，目標(biāo)條帶，要么呈現(xiàn)出非常微弱的狀況，要么出現(xiàn)了并非特異性的擴(kuò)增現(xiàn)象，并且，還有幾個孔，完全沒有任何信號。
客戶送來的樣品，已然存放了一陣子，團(tuán)隊的成員，心急得團(tuán)團(tuán)直轉(zhuǎn)，畢竟反復(fù)凍融，會對核酸完整性造成影響，再這么拖延下去，就連補(bǔ)救的機(jī)會，都不會有了。
李氏后來耗費兩天光陰，自引物之設(shè)計起，自模板質(zhì)量至退火溫度，逐一展開排查。
最后他把矛頭指向了PCR反應(yīng)試劑盒。
二、PCR反應(yīng)試劑盒的核心指標(biāo)，很多實驗室容易忽略
老李跟我講，他們先前始終使用某一品牌的常規(guī)試劑盒，它的價格并非高昂，運用了將近兩年時間也未曾出現(xiàn)過較為嚴(yán)重的問題。
然而，這一回的狀況致使他察覺到，PCR反應(yīng)試劑盒相互之間的差別遠(yuǎn)比他所設(shè)想的還要大得多。
他向我列舉了好些例子，像酶的熱啟動修飾工藝，要是操作欠佳，于低溫環(huán)境下便會出現(xiàn)非特異性延伸情況；又像緩沖液內(nèi)的鎂離子濃度，不同試劑盒的配比間相距甚遠(yuǎn)，這會對擴(kuò)增效率以及特異性造成直接影響。
還有一項關(guān)鍵指標(biāo)是試劑盒對抑制劑和雜質(zhì)的耐受能力。
些許樣品就算歷經(jīng)純化處理，依舊留存少量蛋白質(zhì)、多糖或者酚類物質(zhì)，普通PCR反應(yīng)試劑盒于這些狀況下擴(kuò)增效率會顯著降低。
老李講了這么個情況，此次出現(xiàn)問題的那件樣品，恰好是源自一種相對而言較為特別的基質(zhì)，普通的試劑盒沒辦法應(yīng)對！
之后，他去查閱試劑盒說明，發(fā)覺那批次產(chǎn)品批間差額把控并不穩(wěn)定，有一項關(guān)鍵酶活性單位標(biāo)注范疇過于寬泛。
也就是說，同一盒里的不同批次，實際性能可能差出一截。
三、換一種PCR反應(yīng)試劑盒，結(jié)果完全不同
四月初，老李決定換一款PCR反應(yīng)試劑盒試試。
他并未盲目去追求進(jìn)口大牌，反而是率先梳理出了自身的真實需求，那需求是，樣品類型較為特殊，這就需要具備高抑制劑耐受性，目標(biāo)片段的GC含量偏高，故需要擁有更強(qiáng)的解鏈能力，實驗頻率很高，所以需要批間穩(wěn)定性良好，最好還能夠在室溫存放一段時間。
按照這幾個條件，他篩選了三款PCR反應(yīng)試劑盒做對比測試。
4月7日至4月9日期間，進(jìn)行測試動作的地點，位于他們公司的實驗區(qū)，在此期間連續(xù)完成了三塊96孔板的操作。
他把原來的試劑盒用作第一塊板的對照，其結(jié)果和之前并無二致，條帶呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，背景噪音存在偏高情形。
換了一款試劑盒，是第二塊板所使用的，這款試劑盒宣稱具有高靈敏度，靈敏度確實提升了，然而非特異性擴(kuò)增也有所增加，有幾個引物二聚體跑得極為明顯。
第三塊板所采用的，是另外一款專為應(yīng)對復(fù)雜模板而設(shè)計的PCR反應(yīng)試劑盒，其結(jié)果，使其眼前頓然一亮。
有一個清晰銳利的目標(biāo)條帶，背景是干凈的，并且同一個樣品于不同孔位之間的Ct值差異是非常小的。
老李說那一瞬間，整個實驗室的人都松了一口氣。
四、選擇PCR反應(yīng)試劑盒的三個實操經(jīng)驗
那件事情過后，老李歸納出了幾款經(jīng)驗，我認(rèn)為這些經(jīng)驗對于進(jìn)行分子實驗的友人具備頗高的可供參考的價值。
第一個經(jīng)驗：不要只看品牌，要看匹配度
不同PCR反應(yīng)試劑盒的設(shè)計側(cè)重點不同。
當(dāng)中有的朝著高保真度的方向傾斜，這種適合用于克隆以及測序；當(dāng)中有的朝著快速擴(kuò)增的方向傾斜，這種適合開展大規(guī)模篩選；當(dāng)中有的朝著高抑制劑耐受的方向傾斜，這種適合處理復(fù)雜樣品。
老李講，早些時候他一直認(rèn)為貴的便是好的，現(xiàn)如今他知曉了，尋覓到與自身樣品體系適配的那個款式，相較于一味地追逐進(jìn)口品牌而言更具性價比。
第二個經(jīng)驗：同一樣品，用多個試劑盒做橫向?qū)Ρ?/h3>
老李這次能快速找到問題，一個關(guān)鍵動作就是做了對比測試。
他采用了經(jīng)由同一次配好而成的混合體系，用的是同一批模板以及引物，僅僅是將PCR反應(yīng)試劑盒予以更換，其余所有條件全都維持一致。
這樣對比出來的結(jié)果才公平。
他提議實驗室于引入新試劑盒之際，至少選取三款同類產(chǎn)品去展開平行比較，切莫僅著眼于單次實驗的數(shù)據(jù)，而是要進(jìn)行兩到三個批次的重復(fù)。
第三個經(jīng)驗：注意保存和使用中的細(xì)節(jié)
老李說，有些試劑盒性能不穩(wěn)定，其實跟使用習(xí)慣有關(guān)。
像那種反應(yīng)預(yù)混液要是反復(fù)進(jìn)行凍融操作，那么酶活就會顯著地下降。又比如在加樣之時，當(dāng)沒有充分實現(xiàn)混勻這個動作，或者未曾進(jìn)行短暫的離心處理，如此這般都會對孔間一致性造成影響。
他目前所采取的做法是，在收到新一批次的PCR反應(yīng)試劑盒之后，首先要進(jìn)行分裝，將其分成小份，接著要注明日期以及批號，隨后每次僅僅取用所需要的量。
除此之外，他會于正式實驗之前，去跑一個規(guī)模較小的梯度板，以此來驗證最佳退火溫度，而這一點常常會被忽視，然而實際上卻是極為關(guān)鍵的。
五、從一次故障到一套標(biāo)準(zhǔn)流程
老李他們公司現(xiàn)在建立了一套新的試劑驗收流程。
每一批新抵達(dá)的PCR反應(yīng)試劑盒，都必然要先開展三項基礎(chǔ)測試，一項是靈敏度的梯度稀釋測試，一項是特異性的無模板對照，還有一項是重復(fù)性的孔間變異系數(shù)計算。
只有這三項都通過，才能用于正式樣品。
老李說這套流程看起來增加了工作量，但實際上是節(jié)省了時間。
假設(shè)要是如同先前那般，一直到實驗失敗之際才發(fā)覺原來是試劑存在問題，那么所損耗的可不單單是試劑以及樣品的成本，就連整個項目的周期以及團(tuán)隊的士氣，同樣也是會有所虧損的。
最遲在上個月底的時候，老李運用才新被定下來的PCR反應(yīng)試劑盒另行去重新跑了那一批本來就產(chǎn)生問題的樣品，最終所有的數(shù)據(jù)全都一次性順利通過，客戶方面表現(xiàn)出了極度的滿足感。
他還把這次的經(jīng)驗寫成了內(nèi)部培訓(xùn)材料，分享給同部門的同事。
六、寫在最后
老李的這段經(jīng)歷讓我感觸很深。
許多情形下，實驗未能成功做出，眾人的首要反應(yīng)乃是懷疑自身的操作，或者懷疑引物的設(shè)計，鮮少有人士會去置疑試劑盒自身。
然而，實際上，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒的質(zhì)量出現(xiàn)波動，展現(xiàn)設(shè)計偏向，存在批次差異，這些都極有可能成為致使實驗告負(fù)的關(guān)鍵因素。
要是讀者朋友近來也碰到了擴(kuò)增效率低下，且非特異性條帶眾多，還有靈敏度不足等諸般問題，倒不妨如同老李那般，耗費點時間去做一回試劑盒的橫向比較。
挑選一個同自身樣品體系相匹配的PCR反應(yīng)試劑盒，接著配合規(guī)范的操作流程，好多舊有的毛病或許就會迎刃而解了。
指望老李那實實在在發(fā)生過的經(jīng)歷能夠給眾人某些有所啟迪的東西。要是你同樣存有類似的經(jīng)歷，樂意在腦海之中記下一筆，下次碰見問題之時翻出來瞧瞧，說不定就能夠少走一些冤枉的路。
