近些日子，有個朋友老張，他在生物醫(yī)藥研發(fā)這個領(lǐng)域深入鉆研了好些年，他跟我講起了他最近那一段工作經(jīng)歷，這經(jīng)歷很是波折，卻又收獲頗豐。老張在一家研發(fā)機構(gòu)當(dāng)項目負(fù)責(zé)人，那家機構(gòu)專門熱衷于心血管疾病創(chuàng)新療法的研究。他們那個團隊始終都努力著，通過利用兔原代細(xì)胞，去構(gòu)建更契合人體生理狀態(tài)的疾病模型，以此來加快新藥篩選的流程。假設(shè)你同樣投身于相關(guān)研究工作，或者正因為原代細(xì)胞培養(yǎng)時候存在的穩(wěn)定性問題而感到苦惱煩悶，那么老張經(jīng)歷的這段遭遇困難又解決困難的歷程，也許能夠給你帶來一些切實有用的啟示。
為什么兔原代細(xì)胞在心血管研究中備受青睞？
選擇兔作為模型動物，成了老張團隊的決定，這可不是偶然的。兔的心臟，在大小方面，在結(jié)構(gòu)方面，以及在電生理特性方面，跟人類有著較高的相似性。而這就致使，從兔心臟分離出的原代心肌細(xì)胞，變成了研究心肌缺血、心律失常等疾病的理想工具。和永生化細(xì)胞系比起來，兔原代細(xì)胞保留了體內(nèi)更完整的信號通路，還保留了功能特性，所以實驗數(shù)據(jù)就更具說服力。老張最初就是看中了這一點，才滿懷信心地啟動了項目。
但是，理想是充滿豐富想象的，而現(xiàn)實卻給他來了個沉重打擊。去年秋季的時候，他們的項目步入到關(guān)鍵的數(shù)據(jù)再次審核階段，然而卻接連有好幾次在進(jìn)行重復(fù)試驗的時候遭遇挫折。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因有哪些？
細(xì)胞活性中首先出現(xiàn)了問題，依據(jù)他們多年以來延續(xù)使用的經(jīng)典分離流程來進(jìn)行操作，在十月初那次的關(guān)鍵批次制備期間，當(dāng)細(xì)胞收獲之后，其存活率突然急劇下降到了50%以下，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠達(dá)到實驗所要求的85%。在顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)出消沉萎靡的狀態(tài)，并且貼壁的能力極其糟糕，幾乎根本沒有辦法形成能夠用于后續(xù)電生理檢測的致密單層。
老張回憶說，那段時間，實驗室的氣氛特別壓抑 ，整個項目進(jìn)度停滯不前了 ，我們再三檢查操作步驟 ，從麻醉劑的用量 ，心臟灌流的速率 ，消化酶的品牌以及濃度 ，到離心重懸的力量 ，每一個環(huán)節(jié)好似嫌疑犯一樣。他們甚至懷疑是實驗動物的批次存在問題 ，然而更換了供應(yīng)商以后 ，情況依舊沒有得到根本性的改善。
如何優(yōu)化兔原代心肌細(xì)胞的分離與純化流程？
排除了操作方面以及動物來源出現(xiàn)的顯性因素后，老張緊接著把目光投向了更底層的、更為精細(xì)的環(huán)節(jié)，他組織團隊開展了一回徹頭徹尾的“流程復(fù)盤”，又引入了更加精細(xì)的監(jiān)控指標(biāo)，他們隨后發(fā)現(xiàn)，問題的核心極有可能隱匿在“時間”以及“環(huán)境”這兩個極易被忽略的 dimension里。
此處所指的乃是組織離體之后的處理“時間窗”，往昔之時，他們對于消化時間予以了更多的關(guān)注，然而針對從動物實施安樂死起始，直至把心臟取出，進(jìn)而進(jìn)入灌流系統(tǒng)的這段“冷缺血時間”進(jìn)行把控的時候卻顯粗放，借由嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)必將這段時間控制在3分鐘內(nèi)側(cè)，并且運用預(yù)冷的、成分清晰明確的緩沖液來開展快速轉(zhuǎn)運，細(xì)胞初始損傷幅度顯著下降。
在消化進(jìn)程里的“微環(huán)境”。先前他們所用的消化液配方較為固定下來，然而卻忽視了不同批次酶活性存在的細(xì)微差別以及消化進(jìn)程中溫度發(fā)生波動所產(chǎn)生的影響。老張團隊引進(jìn)了帶有實時pH以及溫度監(jiān)測功能的灌流系統(tǒng)，并且把“分步消化、及時收集”的原則落實得更加徹底，也就是說消化那么一段時間之后，就去收集含有已經(jīng)游離出來的細(xì)胞的液體，馬上加入含有血清的培養(yǎng)基來終止消化，并非等到全部組織塊都消化完畢之后再統(tǒng)一進(jìn)行處理。這樣的一個改變，切實有力地保護(hù)了先期游離出來的、品質(zhì)處于最佳狀態(tài)的那一批細(xì)胞。
怎樣維持兔原代細(xì)胞體外培養(yǎng)的高活性和功能？
分離環(huán)節(jié)的問題得以解決，這僅僅如同萬里長征邁出的頭一步，怎樣促使這些嬌弱的細(xì)胞于培養(yǎng)皿之中，要能夠使得它們“活得很不錯”同時“干得蠻出色”（維持其收縮、電信號傳導(dǎo)等特定功能），這構(gòu)成了更為艱巨的挑戰(zhàn)，老張團隊針對培養(yǎng)體系開展了數(shù)量眾多的優(yōu)化嘗試。
他們察覺到，僅僅運用高血清含量的經(jīng)典培養(yǎng)基時，細(xì)胞雖說能夠存活，然而易于過快地“去分化”，進(jìn)而喪失成熟心肌細(xì)胞的典型特性，在經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研以及條件篩選后，他們最終采用了一種專用培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基具備低血清的特點，還添加了特定的細(xì)胞因子，譬如 IGF - 1，以及代謝底物，像是肉堿，這種培養(yǎng)基仿佛是為細(xì)胞量身定制的“工作餐”，它既能夠維系細(xì)胞的基本代謝，又能夠激勵細(xì)胞保持“工作狀態(tài)”，也就是特異性功能。
培養(yǎng)基底的挑選同樣是相當(dāng)關(guān)鍵的，傳統(tǒng)的明膠包被成效并不穩(wěn)定，他們對多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（像是層粘連蛋白、纖連蛋白）的各異包被濃度以及條件做了測試，最終明確了最適宜兔原代心肌細(xì)胞伸展以及形成功能性網(wǎng)絡(luò)的包被方案。今年三月，在上海浦東的研發(fā)中心，當(dāng)老張于共聚焦顯微鏡下瞧見培養(yǎng)第五天的細(xì)胞依舊規(guī)律、同步地搏動，并且記錄到強勁、穩(wěn)定的動作電位時，他懸了半年多的心終于落了地。
兔原代細(xì)胞實驗數(shù)據(jù)不穩(wěn)定的解決方案
往回看時，老張所秉持這樣的看法，兔原代細(xì)胞進(jìn)行實驗的成功或者失敗，重要之處在于“標(biāo)準(zhǔn)化”情形還有“精細(xì)化”狀況。眾多數(shù)據(jù)出現(xiàn)波動，究其根源是一些可變參數(shù)沒有受到有效的把控。他把他自身的經(jīng)驗歸結(jié)為三個要點：
建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）并嚴(yán)格予以遵守，特別要對那些易被經(jīng)驗取代的步驟實行量化，像組織精確的修剪尺寸，消化液的流速，離心力以及時間等。
著重關(guān)注原料以及試劑的質(zhì)量把控，不單單是像膠原酶、胰蛋白酶這類關(guān)鍵酶，涵蓋基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、包被材料，甚至連配制用水也要構(gòu)建起嚴(yán)格的驗收以及批次記錄制度；不同批次所存在的差異，或許就要通過微調(diào)后續(xù)參數(shù)去予以彌補。
強化過程的監(jiān)控工作，切不可單單依靠終點時的細(xì)胞計數(shù)以及染色的結(jié)果，于分離、培養(yǎng)的關(guān)鍵時間節(jié)點上，借助臺盼藍(lán)染色、乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測等方式來開展中間品控，如此能夠及時察覺問題，進(jìn)而對后續(xù)步驟作出調(diào)整。
歷經(jīng)這一連串系統(tǒng)性的優(yōu)化，老張團隊不但化解了當(dāng)下的項目危機，而且把兔原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)成功率穩(wěn)固在了90%以上，實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性以及可靠性顯著提高，為新藥候選分子的體外評價給予了堅實的數(shù)據(jù)支持。這段從屢屢失敗邁向穩(wěn)定成功的進(jìn)程，使他深切領(lǐng)悟到，在生命科學(xué)研究里，特別是涉及原代細(xì)胞這類敏感材料之際，對細(xì)節(jié)的把控常常決定了結(jié)果的趨向。于每一個穩(wěn)定且可信的實驗數(shù)據(jù)的背后呀，都必然是少不得對于流程上面每一環(huán)的進(jìn)行深思熟慮以及持續(xù)不斷地打磨的呢。
