在去年的那個(gè)秋天，一個(gè)契機(jī)使我結(jié)識(shí)了一位朋友，這位朋友在生物技術(shù)公司從事產(chǎn)品研發(fā)工作，他姓周，大家都喚他老周。他曾于一家中型企業(yè)任職長達(dá)六年之久，其主要負(fù)責(zé)的工作內(nèi)容乃是分子檢測方法的優(yōu)化事宜。老周此人，技術(shù)方面的根基極為扎實(shí)。但其存在著一個(gè)問題，即太過堅(jiān)信“貴的就是好的”這一觀點(diǎn)。每當(dāng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR這項(xiàng)操作時(shí)，他始終堅(jiān)決保持持選用最為昂貴的試劑盒以及采用最為復(fù)雜的流程這種做法，自認(rèn)為唯有如此才能夠確保所獲取的數(shù)據(jù)不會(huì)受到他人的質(zhì)疑。
但在去年十月份的時(shí)候，發(fā)生了一件事，這件事徹底改變了他的想法。那時(shí)，他們公司接了一個(gè)來自大客戶的訂單，該訂單要求在兩周內(nèi)完成2000份樣本的病原微生物定量檢測。由于時(shí)間緊迫，任務(wù)繁重，老周依照老習(xí)慣，直接使用了某個(gè)進(jìn)口品牌的高端試劑。然而，第一輪檢測跑下來，成本直接超出了標(biāo)準(zhǔn)40%。老板找他談話，所說的話語里話外就表達(dá)了一個(gè)意思：再按照這樣的方式干下去，項(xiàng)目就會(huì)虧錢。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑選擇真的有門道嗎？
那幾天，老周愁得晚上根本沒法入睡，他私下里同一個(gè)人吐槽，說他在那里干了六年，從來就沒有任何人告訴他，試劑居然能夠按照場景來選擇，他一直以來都覺得越是昂貴就越好，越是通用就越安全。
他后來被逼迫著去開展對(duì)各個(gè)品牌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑的研究工作 ，他耗費(fèi)了整整三天的時(shí)間 ，將市面上諸多主流品牌以及國產(chǎn)平替試劑的說明書逐一翻閱了個(gè)遍 ，還尋覓了幾位在檢測機(jī)構(gòu)就職的老同學(xué)去打探實(shí)際所產(chǎn)生的使用體驗(yàn)。最終他察覺到 ，許多被吹噓得神乎其神的 “高靈敏” 試劑 ，在常規(guī)定量這類場景當(dāng)中 ，與普通試劑所呈現(xiàn)出來的數(shù)據(jù)根本相差不多。
區(qū)別的關(guān)鍵所在是引物探針的匹配程度以及擴(kuò)增效率，并非價(jià)格銘牌。舉例來講，有的試劑對(duì)于GC含量偏高的模板格外友善，有的試劑卻是對(duì)低拷貝數(shù)的樣本更為敏感。老周以往從來都不關(guān)注這些的，如今他把每一個(gè)樣本的模板特性都列舉出來，接著選取對(duì)應(yīng)場景的試劑，成本徑直砍掉了一半。
如何設(shè)置最優(yōu)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系？
光進(jìn)行試劑更換是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，老周察覺到他所身處的反應(yīng)體系存在著極為嚴(yán)重的問題。他往昔開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作時(shí)，一貫都有著將模板添加至上限的習(xí)慣，內(nèi)心認(rèn)為模板加多了必然信號(hào)就會(huì)很強(qiáng)。然而這般做法極易致使酶的反應(yīng)體系被撐破，進(jìn)而引發(fā)非特異性擴(kuò)增的情況出現(xiàn)。
今年一月上旬，他開展了一回對(duì)比試驗(yàn)。至于同一批次的樣本 ，當(dāng)初照著老辦法添加了5微升的模板 ，然而結(jié)果是Ct值于28至32區(qū)間內(nèi)無序蹦跳著 ，且重復(fù)性表現(xiàn)糟糕透頂。過后呢，在按照優(yōu)化好的方案的狀況下 ，先將模板量減低至2微升 ，與此同時(shí)還把引物濃度由0.4微摩爾每升改動(dòng)為0.3 微摩爾每餐吶 ，鎂離子濃度方面 同樣做出了細(xì)微的調(diào)整?？山Y(jié)果簡直讓人驚掉下巴：Ct值穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)定格在了30.2至30.5區(qū)間內(nèi) ，三個(gè)復(fù)孔的CV值從先前的15%降低到了3%以下，很是驚人！
老周跟我講，他原以為體系越滿越棒，實(shí)則每個(gè)成分都存在自身最佳濃度區(qū)間，一旦超出此區(qū)間，系統(tǒng)就不穩(wěn)定了。之后他把這事寫成內(nèi)部培訓(xùn)材料，標(biāo)題稱作《實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的三個(gè)黃金法則》，如今他們整個(gè)研發(fā)部門都在運(yùn)用這套標(biāo)準(zhǔn)。
擴(kuò)增曲線異常到底該怎么排查？
二月中旬的時(shí)候，老周再度碰到了新的狀況，有一批樣本的擴(kuò)增曲線老是呈現(xiàn)出雙峰的情形，并且平臺(tái)期的信號(hào)一會(huì)兒高一會(huì)兒低，他起初懷疑是受到了污染，于是把整個(gè)操作臺(tái)進(jìn)行了兩遍消毒處理，更換了新的槍頭，再度配置了體系，然而問題依舊存在。
他在之后跟我就這件事進(jìn)行復(fù)盤講述時(shí)講道，他差一點(diǎn)就將這二百個(gè)樣本全部弄成報(bào)廢狀態(tài)了。還好他在一個(gè)行業(yè)論壇之上看到了一個(gè)帖子，其內(nèi)容講的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR里面的引物二聚體相關(guān)問題。接著他回到回去之后把引物重新進(jìn)行了一遍設(shè)計(jì)，使引物序列得到了加長，并且提高了退火溫度，而且還做了梯度PCR用以確定最佳的退火溫度。
跑完以后再改，擴(kuò)增曲線清清爽爽，單峰、陡峭、且平臺(tái)期呈平直狀。老周舒了一口氣，講：“有時(shí)問題并非在于操作自身，而是在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最起始之處。引物設(shè)計(jì)欠佳，后續(xù)的全部努力都將付諸東流?！?。
如何利用內(nèi)參基因提高實(shí)時(shí)熒光定量PCR的可靠性？
四月份之際，老周承接了一項(xiàng)更為復(fù)雜的任務(wù)，具體內(nèi)容為進(jìn)行多個(gè)組織樣本的基因表達(dá)差異分析。此次樣本的來源豐富多樣，存在經(jīng)過凍存的，有新鮮提取所得的，另外還有經(jīng)過甲醛固定處理的。倘若運(yùn)用同一個(gè)內(nèi)參基因去實(shí)施歸一化的操作，那么最終的結(jié)果必定是不準(zhǔn)確的。
這下老周可學(xué)機(jī)靈了，他先是針對(duì)每一個(gè)樣本開展了RNA質(zhì)量評(píng)估的工作，隨后挑選出三個(gè)候選的內(nèi)參基因去進(jìn)行穩(wěn)定性測試，他察覺到，在部分樣本當(dāng)中，GAPDH的表達(dá)量出現(xiàn)了極大的變化，不過beta-actin卻呈現(xiàn)出很穩(wěn)定的態(tài)勢，等到換成另外一批樣本時(shí)，狀況卻完全顛倒過來了，最終他綜合運(yùn)用了兩個(gè)內(nèi)參基因并求得幾何平均值，才精細(xì)地把數(shù)據(jù)歸一化妥當(dāng)。
他跟我講，以往他認(rèn)為內(nèi)參乃是固定搭配，如今才曉得，各異的樣本適配的內(nèi)參全然不一樣。不開展預(yù)實(shí)驗(yàn)就生硬套用公式，得出的數(shù)據(jù)壓根不可信。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析該用哪種方法？
當(dāng)數(shù)據(jù)跑出來以后，老周又遭遇到一個(gè)抉擇：是采用絕對(duì)定量呢，還是運(yùn)用相對(duì)定量呢？他先前對(duì)于這個(gè)問題的領(lǐng)會(huì)始終是模模糊糊的，認(rèn)為不管怎樣都是在計(jì)算拷貝數(shù)，差異并不是很大。
這下，他針對(duì)兩種方法的原理開展了認(rèn)真的研究。絕對(duì)定量這一方式，是需要去構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的，并且對(duì)于擴(kuò)增效率的要求是極高的那種狀態(tài)，同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性可是會(huì)直接對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的，其關(guān)聯(lián)程度不容小覷。而相對(duì)定量呢，借助內(nèi)參歸一化這種手段來達(dá)成評(píng)估，它更多地是去關(guān)注基因表達(dá)的變化倍數(shù)情況，在絕對(duì)拷貝數(shù)方面的要求并不高，也就是沒那么嚴(yán)格的那種程度。
他最終做出決定，針對(duì)客戶所要求的病原微生物拷貝數(shù)，運(yùn)用絕對(duì)定量加標(biāo)準(zhǔn)曲線方式來處置；對(duì)于用于內(nèi)部研究的基因表達(dá)分析，則采用相對(duì)定量法，借助2的負(fù)delta delta Ct公式。這兩種方法各盡其責(zé)，其各自的數(shù)據(jù)質(zhì)量以及合理性都有了顯著提升，上升到了一個(gè)新的層面。
如何避免實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的常見操作失誤？
五月初時(shí)，老周針對(duì)所有這般經(jīng)驗(yàn)實(shí)施了一回系統(tǒng)復(fù)盤，經(jīng)整理后形成了他們實(shí)驗(yàn)室的SOP。他著重突出了操作細(xì)節(jié)具備的重要性：加樣之際，槍過頭需緊挨著管壁插入，以此規(guī)避產(chǎn)生氣泡；封膜時(shí)候要壓實(shí)，用于防止因蒸發(fā)致使體系體積出現(xiàn)變化；上機(jī)以前務(wù)必開展短暫離心，將管壁上的液體甩至底部。
他特意提出，每次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，都要設(shè)置無模板對(duì)照，還要設(shè)置無逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照，這是用于判斷是否存在污染以及有無基因組DNA殘留的唯一方法。之前他認(rèn)為這些對(duì)照是對(duì)試劑的浪費(fèi)，如今他明白，沒有對(duì)照所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，基本上就是沒有實(shí)際效用的數(shù)據(jù)。
他們公司的技術(shù)骨干是老周，現(xiàn)在每個(gè)月老周都要給新員工做培訓(xùn)。老周常跟新人說這樣一句話：“實(shí)時(shí)熒光定量PCR不是一個(gè)能湊合的技術(shù)，每一個(gè)環(huán)節(jié)都要較真。從被老板罵到之后被老板夸，將我二者分隔開來的，中間差的不是運(yùn)氣，是對(duì)細(xì)節(jié)懷揣的敬畏之情?！?。
要是你恰好置身于同實(shí)時(shí)熒光定量PCR存在關(guān)聯(lián)的情境之中，倘若有可能的話，不妨自當(dāng)下這一日起始，去查驗(yàn)一番你所選用的試劑，審視一下反應(yīng)體系，核查引物設(shè)計(jì)狀況，進(jìn)而評(píng)判數(shù)據(jù)分析途徑到底如何。唯有成本能夠?qū)崿F(xiàn)降低，數(shù)據(jù)趨向精準(zhǔn)無誤，如此這般才稱得上是具備久經(jīng)時(shí)日方可顯現(xiàn)的那種價(jià)值的體現(xiàn)。
