你最近是不是也覺得PCR擴增太慢了？
上星期三的下午時分, 我于實驗室待了一整個下午, 眼睛直盯著那臺PCR儀, 內心著急得好似熱鍋之上的螞蟻?？蛻舸叽僦Y果, 老板在微信里追問進展情況, 然而我的擴增程序仍舊滯留在第二階段的循環(huán)之中, 時間一秒一秒地消逝, 樣品卻始終沒有給出結果。
我有個朋友, 他叫老周, 于一家從事生物相關業(yè)務的公司擔任研發(fā)主管一職, 其手下帶領著五六名人員。他這個人在處理事情方面向來表現(xiàn)得利落干脆, 然而卻偏偏遭受PCR擴增效率這一問題的困擾長達大半年時間。每一次召開組會的時候, 老板都會出聲詢問說: “老周, 你們組所負責的項目周期可不可以再度進行壓縮? 客戶已經等得不耐煩了?！薄?/p>
老周露出苦笑, 他心里比任何人都明白, PCR擴增存在的瓶頸之處在于那套傳統(tǒng)的試劑盒。進行一次完整流程, 至少需要一個半小時, 倘若遇到復雜模板的時候或者引物設計并非特別理想情況下, 兩三個小時都是很正常的狀態(tài)。更讓人感到煩躁抓狂的是, 有時候完成操作后查看電泳圖, 條帶要么呈現(xiàn)模糊的狀況, 要么徑直就沒有出現(xiàn)相應條帶, 如此一來又不得不重新做上一遍。那段時期。老周的臉幾乎就要變成苦瓜的模樣了。
快速PCR擴增試劑盒真的快嗎
老周向我傾訴不滿時, 我不經意間講了一句: “你有沒有嘗試過快速擴增試劑盒呀? ”。
他當時愣了一下, 隨后說道, 他用過, 在這之前購買過幾個不同品牌的, 那些品牌聲稱半小時就能搞定, 然而實際情況呢, 要么是擴增效率很低, 要么是非特異性條帶多得簡直嚇人, 穩(wěn)定性實在太差勁了, 根本就沒辦法用來干事兒。
實際上, 我對老周所遭受的情況是極其能夠理解的。在市面上, 的確存在著一些被稱為“快速”的產品, 然而, 其中有好多僅僅是在溫度循環(huán)程序方面進行了簡化處理, 并沒能從根源上把酶的活性問題給解決掉?？焖贁U增本身對于酶所提出的要求是極為高的, 其既要能夠耐受高溫, 又要有很高的延伸速度, 同時還得具備良好的錯配率控制能力。要是沒辦法達成這三點之間的平衡, 那么所說的“快速”就純粹只是一句空話而已。
老周起初也進到過這類陷阱, 耗費了諸多本不該花的錢, 嘗試了好些不同的牌子, 然而最終的情形都未達預期。他曾有一段時期對“快速PCR擴增試劑盒”這個物品類別萌生了質疑, 認為這大概僅僅是一種營銷的虛頭。
快速PCR擴增試劑盒哪個牌子好
但今年三月份，事情出現(xiàn)了轉機。
那天, 老周前往參加一個行業(yè)交流會, 在交流會中, 坐在他身旁的一位同行談起了自身的項目進度, 這位同行說道, 他們公司近期更換了一款全新的快速PCR擴增試劑盒, 該試劑盒能夠在四十分鐘至六十分鐘的時間范圍內完成擴增, 并且所呈現(xiàn)的條帶清晰, 其重復性尤為出色, 老周一聽聞此言, 眼睛瞬間亮了起來。
他當場就問：“哪個牌子的？”
老周聽同行提到他們近期正在使用的一款產品, 記住了那個產品的名字, 回來后就去尋找渠道拿了一批樣品。他因為之前有過被坑的經歷很害怕, 所以此次格外謹慎, 先拿自己手上難度極大, 是呈現(xiàn)有一個GC含量高達百分之六十五的基因片段的模板做了測試。
結果出乎他的意料。
在三月中旬推進了第一批測試, 老周親自對機器予以密切關注督查, 歷經四十多分鐘，擴增宣告結束, 他提取產物進行電泳操作, 當目睹結果之際, 不禁發(fā)出“嚯”的一聲, 條帶呈現(xiàn)出又亮且銳利的狀態(tài), 幾乎不存在背景雜帶, 縱使是一直擴增未成功的高GC區(qū)域也順利出現(xiàn)條帶, 他即刻將結果拍攝照片發(fā)送給老板, 老板回復了一個大拇指！
快速PCR擴增試劑盒能省多少時間
老周后來越用越順，他算了一筆賬。
過去使用傳統(tǒng)試劑盒時, 一個完整的擴增流程, 還要加上準備時間、跑膠時間, 一個樣品起碼需要三至四個小時。要是碰到需要對退火溫度進行優(yōu)化的情況, 就得重復操作三四回, 一天下來最多也就能夠做兩組實驗。
眼下更換了該款快速PCR擴增試劑盒, 其一整套流程被壓縮至六十到七十分鐘。若僅是進行簡單擴增, 即便四十分鐘便能夠完成。一日之內, 他可輕便操控四到五組實驗, 效率提升幅度已然超過一倍。更為關鍵之處在于, 他無須頻繁進行重復實驗, 原因在于一次成功率自先前的百分之六七十提升至百分之九十以上。
那時候的老周, 整個人發(fā)生了改變, 開會之際, 臉上浮現(xiàn)出了笑容, 老板也不再對他進行催促, 他甚至擁有了精力, 去思索一些以往沒有時間去做的優(yōu)化實驗。
當然, 這款試劑盒并非毫無瑕疵。老周講, 它對于模板質量的要求相較于傳統(tǒng)試劑盒略高些, 要是模板降解程度嚴重, 又或者純度不足, 擴增效率依舊會受到影響。然而, 這乃是所有快速擴增產品所共有的特性, 并非它特有的問題。只要平常提取核酸之際留意操作規(guī)范, 大抵不會出現(xiàn)問題。
快速PCR擴增試劑盒適合哪些實驗
當我把老周所擁有的經驗分享給在身邊進行實驗的朋友之際, 好多人都在詢問同一個問題, 那便是: 它適合去做怎樣的實驗呢?
老周自己的體會是，這款試劑盒在以下幾種場景下表現(xiàn)尤其出色：
首先, 第一個場景是常規(guī)基因克隆以及鑒定, 就像你從菌落里挑取單克隆去做PCR驗證似的, 在前過去的時候可能得等來一個半小時才能夠看著結果, 然而當前才四十分鐘就把那個結果確定出來了, 對于大量樣品篩選這項工作而言, 所節(jié)省下來的這樣一個時間段是極其可觀的。
第二個場景為基因分型以及突變檢測, 因其擴增特異性良好, 非特異性條帶數(shù)量少, 故而在進行SNP檢測或者點突變驗證之際, 結果極為清晰, 無需反復跑膠予以確認。
第三個場景為快速病原體檢測, 老周有位同事在做環(huán)境微生物監(jiān)測, 其要快速判定樣品里是否含有特定病原菌, 使用這款試劑盒后, 整個檢測流程從原本的四個小時被壓縮至兩個小時以內, 極大提高了出報告的速度。
即便如此老周依舊提示, 要是開展高保真克隆之實驗, 或者進行長片段擴增的一類實驗, 還得依據(jù)具體所需挑選適宜的酶。再說快速試劑盒于片段長度這塊兒, 以及保真度方面, 跟傳統(tǒng)的保真型酶存在一定的差距呢。
快速PCR擴增試劑盒的穩(wěn)定性怎么樣
在用了大概兩個月之后, 老周, 我也, 對這款試劑的穩(wěn)定性產生, 了好奇。畢竟, 他原先踩過不少坑, 這次能夠堅持使用下來, 這, 就表明穩(wěn)定性必定是過關的。
四月底之際, 我去往老周的實驗室找他談事, 彼時恰巧瞧見他在開展批量驗證, 他一日之內作出六十個樣品, 所用皆為同一批次的快速PCR擴增試劑盒, 我目睹他完成電泳, 六十個孔位的條帶齊齊整整, 亮度相同, 背景潔凈, 他稱這是他連續(xù)測試的第五批樣品了, 每次的結果皆高度重復。
老周講, 這款試劑盒穩(wěn)定性佳, 關鍵在于其聚合酶, 酶活性頗高, 即便處于快速循環(huán)狀況下, 也能夠維持穩(wěn)定的延伸速度, 況且對于抑制劑的耐受性也較為良好, 并且配方之中添加了一些特殊的緩沖組分, 能夠更優(yōu)地維系酶在高溫時的構象穩(wěn)定性, 這些細節(jié)普通用戶雖無法瞧見, 但卻直接限定了實驗結果的可靠程度。
他如今已然全然將實驗室的常規(guī)擴增替換成了這款快速PCR擴增試劑盒, 采購部那邊也進行了統(tǒng)計, 單就試劑成本而言, 實際上與傳統(tǒng)試劑盒相近, 然而由于減少了重復實驗的次數(shù), 總體實驗成本反倒降低了百分之二十左右。
倘若你跟老周先前那般, 遭受PCR擴增效率低下這一問題的困擾, 不妨去嘗試換一款切實好用的快速PCR擴增試劑盒。有時, 一個細微層面的工具升級, 便能夠使整條實驗線的節(jié)奏加快。
