我的朋友老趙，一個被“檢測”折磨了三年的實(shí)驗(yàn)員
我在生物行業(yè)認(rèn)識了快十年的朋友是老趙, 他在一家第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)分子檢測平臺的日常運(yùn)營。三年前, 他剛接手這個崗位, 當(dāng)時(shí)算得上是意氣風(fēng)發(fā), 他覺得自己手里拿著一堆進(jìn)口設(shè)備和試劑, 什么樣的項(xiàng)目都能夠搞定?？墒? 現(xiàn)實(shí)很快就給他來了一個下馬威, 他所在的實(shí)驗(yàn)室承接了大量呼吸道病原體檢測任務(wù), 樣本來源十分復(fù)雜, 有從咽拭子到痰液的, 有從兒童到老人的, 有從門診到住院的, 各種情況無所不包。
彼時(shí), 老趙向來最為懼怕目睹的便是PCR擴(kuò)增曲線出現(xiàn)狀況, 不是內(nèi)標(biāo)未起作用, 要不就是目的條帶隱隱約約, 要不然就是直接呈現(xiàn)一片空白, 他嘗試過更換提取試劑, 更換酶, 更換耗材, 甚至將實(shí)驗(yàn)員的操作流程自始至終梳理了三遍, 然而問題依舊時(shí)而良好時(shí)而糟糕, 2023年秋季的一個午后, 他坐在實(shí)驗(yàn)室門口的花壇邊緣, 滿臉愁容地跟我講: “我感覺并非操作方面的問題, 或許是我所選用的試劑盒本身就不太恰當(dāng)?！?。
通用RT-PCR試劑盒真的能“通用”嗎？
針對老趙所面臨的那個問題, 實(shí)際上是眾多實(shí)驗(yàn)室均會遭遇的核心矛盾。在市面上所銷售的RT-PCR試劑盒之中, 有許多均宣稱具備“通用”的特性, 然而, 究其所稱的通用, 究竟能夠通用至何等程度呢? 老趙最初所選用的乃是一款進(jìn)口品牌的通用一步法試劑盒, 其說明書明確表示適用于針對各類RNA病毒展開檢測, 他對此深信不疑。可是, 從實(shí)際投入使用的情況加以觀察, 這個所謂的“通用”, 似乎更像是專門針對標(biāo)準(zhǔn)化樣本而進(jìn)行設(shè)計(jì)的——該樣本的背景較為干凈、病毒載量處于較高水平、核酸質(zhì)量良好。
那老趙所面對的樣本, 好多是從基層醫(yī)院送來的, 其保存條件有著巨大差異, 有的咽拭子放置在常溫狀態(tài)下超過48小時(shí)之后才被送到實(shí)驗(yàn)室, 有的痰液樣本帶有大量黏液物質(zhì), 有的甚至混入了血液成分, 這種樣本當(dāng)中的RNA降解程度極為嚴(yán)重, 并且還帶有大量PCR抑制物, 而那個進(jìn)口試劑盒的體系對于抑制物的耐受能力非常弱, 最終的結(jié)果便是, 高載量的樣本還能夠勉強(qiáng)出現(xiàn)條帶, 降低載量或者降解的樣本基本上呈現(xiàn)為一片空白。老趙開展了對比實(shí)驗(yàn), 樣本是同樣的, 換用了另一款國產(chǎn)通用的RT-PCR試劑盒, 內(nèi)標(biāo)的Ct值能夠穩(wěn)定處于28至30之間, 目的條帶的檢出率直接提升了將近20個百分點(diǎn)。
為什么同樣的樣本，換了試劑盒結(jié)果差這么多？
一開始, 是老趙, 后來他花費(fèi)了差不多有兩周的時(shí)間, 特意專門去研究這個問題。他把市面上主流的幾款通用RT - PCR試劑盒全都拿來，進(jìn)行平行測試, 所使用的是一批已知呈現(xiàn)陽性然而Ct值偏高了一些的弱陽性樣本。當(dāng)測試的結(jié)果出來的那天晚上, 他給我發(fā)送了一條很長的微信, 其核心意思是這樣表述的: 針對所謂的“通用”試劑盒而言, 關(guān)鍵的區(qū)別體現(xiàn)于逆轉(zhuǎn)錄酶以及緩沖體系的兩者耐受能力方面。
關(guān)于一些試劑盒, 它們采用的是普通的M - MLV逆轉(zhuǎn)錄酶, 這種酶對于RNA模板質(zhì)量有著極高要求, 只要RNA出現(xiàn)哪怕輕微的降解情況, 或者樣本當(dāng)中存在雜質(zhì), 那么逆轉(zhuǎn)錄效率便會大幅度下降。而老趙后來更換的那款國產(chǎn)通用RT - PCR試劑盒, 它所使用的是經(jīng)過工程化改造的嗜熱逆轉(zhuǎn)錄酶, 這種酶具備更強(qiáng)的耐熱性, 能夠在更高溫度條件下完成逆轉(zhuǎn)錄過程, 并且在其緩沖體系當(dāng)中添加了特殊的抑制物清除劑。2024年1月, 他特意前往那家試劑盒的生產(chǎn)工廠, 進(jìn)行了一番考察, 他察覺到, 在研發(fā)的階段, 他們就已然考慮到了臨床樣本的復(fù)雜性, 運(yùn)用了大量真實(shí)的臨床樣本去做驗(yàn)證, 并非僅僅只是使用純化的標(biāo)準(zhǔn)品。
老趙是怎么找到那個“對”的通用RT-PCR試劑盒的
是這個過程實(shí)際上并沒有太多戲劇性的。老趙并非那種一拍腦袋就去做決定的人。他先是于2023年11月參加了一場行業(yè)展會, 在展臺上看見了那款國產(chǎn)通用RT-PCR試劑盒的宣傳資料。那時(shí)也沒太把它當(dāng)回事, 僅僅覺得價(jià)格相較于進(jìn)口的便宜了不少, 便拿了幾盒樣品回來進(jìn)行測試。第一輪測試使用的是實(shí)驗(yàn)室留存的陽性樣本, 結(jié)果還算可以, 但老趙并沒有著急去更換。
后來, 他做了一件事, 我認(rèn)為眾多實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人都應(yīng)當(dāng)學(xué)習(xí), 他將那款試劑盒拿去在自己實(shí)驗(yàn)室最棘手的那批樣本上展開測試, 那批樣本是保存條件欠佳、經(jīng)過反復(fù)凍融、Ct值處于35以上的弱陽性樣本。結(jié)果而言, 進(jìn)口試劑盒的檢出率不足六成, 而那款國產(chǎn)通用RT-PCR試劑盒的檢出率超過了八成。老趙講, 這個數(shù)據(jù)令他完全信服了。2024年3月, 他們將實(shí)驗(yàn)室的呼吸道病毒檢測項(xiàng)目統(tǒng)統(tǒng)轉(zhuǎn)換成了這款試劑盒, 自那時(shí)起, 由于“跑不出條帶”致使返工的情形近乎絕跡了。
通用RT-PCR試劑盒怎么選才能不踩坑？
有個老趙, 如今變成了那款國產(chǎn)通用的RT - PCR試劑盒的忠實(shí)使用者, 然而他也曾告訴過我, 并非所有實(shí)驗(yàn)室都適宜使用同一類試劑盒。關(guān)于試劑盒的選型事宜, 關(guān)鍵核心在于要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的樣本模樣類型選取。要是你的樣本來源較為單一, 好比全都是門診采集的新鮮咽拭子部分物品 , RNA降解程度不那么嚴(yán)重, 抑制各種物質(zhì)也罕有不多, 那么在市面上眾多的通用RT - PCR試劑盒大多數(shù)都能夠采用使用。但要是你如同老趙這般, 常年持續(xù)獲取接收各種基層醫(yī)院送來的、保存狀況條件沒法控制的樣本, 那么在挑選抉擇試劑盒的時(shí)候就要把幾個一些重要指標(biāo)作為重點(diǎn)關(guān)注考察的要點(diǎn)。
要看逆轉(zhuǎn)錄酶之耐熱性及其耐受抑制物的能力, 其次, 要看緩沖體系之中有無添加抑制物清除劑這般成分比如BSA或者海藻糖, 再者, 要看試劑盒的靈敏度與特異性數(shù)據(jù)是采用何種樣本做的驗(yàn)證——倘若僅僅用純化標(biāo)準(zhǔn)品去做, 那么參考意義便有限, 老趙于現(xiàn)在給新員工培訓(xùn)之際, 最后必定會添上一句: 別信宣傳冊上的“通用”, 信你自身的對比數(shù)據(jù), 這句話, 我認(rèn)為是所有從事分子檢測者最應(yīng)當(dāng)記住的。
一個通用RT-PCR試劑盒，幫老趙省了一半的返工時(shí)間
老趙家的工作節(jié)奏, 在更換試劑盒之際, 出現(xiàn)了事態(tài)迥異的顯著轉(zhuǎn)變。往昔之時(shí), 每一周里, 最少得運(yùn)用一至兩個午后, 處理重復(fù)性的樣本, 開展再度提取、再度擴(kuò)增以及再度分析的工作, 對于實(shí)驗(yàn)員而言, 加班加點(diǎn)去干活兒實(shí)屬習(xí)以為常的情況。現(xiàn)階段, 返工的幾率從原先階段的百分之十幾, 下降至不足百分之三, 實(shí)驗(yàn)室的普遍效率得到了大幅度的提高。2025年的夏季, 老趙所在的實(shí)驗(yàn)室承接了一項(xiàng)政府托付的大規(guī)模呼吸道病原體篩查項(xiàng)目, 要求在兩周以內(nèi), 完成一萬多份樣本的檢測任務(wù)。倘若使用先前的進(jìn)口試劑盒, 老趙預(yù)先估量稱, 至少得加班至凌晨方可完成。然而, 在更換了那一款國產(chǎn)通用的 RT-PCR 試劑盒以后, 項(xiàng)目得以順利完成, 并且每天下班的時(shí)間能夠維持在晚上八點(diǎn)之前。
老趙曾于某次飯局提及, 他認(rèn)為挑選試劑盒這一行為, 恰似挑選搭檔那般?？此乒δ芎翢o二致, 然而唯有真正共事之后, 方可明晰誰是值得信賴的。他所打的那個比方, 我當(dāng)時(shí)并未全然領(lǐng)會, 待后來思索一番, 的確極為恰當(dāng)。一款能夠在真實(shí)且繁雜的樣本當(dāng)中穩(wěn)定給出結(jié)果的通用 RT-PCR 試劑盒, 便是實(shí)驗(yàn)室里最為靠譜的技術(shù)層面的搭檔。
