給我打電話的是上個(gè)月在北京某研究所工作的我的朋友阿杰, 他的聲音帶著明顯的疲憊, 他在那里從事免疫學(xué)方向的研究, 已經(jīng)有三年多的時(shí)間, 平時(shí)主要負(fù)責(zé)做細(xì)胞因子檢測(cè), 電話里他講: “我快要被這個(gè)實(shí)驗(yàn)逼到瘋狂的地步了, 都重復(fù)了三周了, 數(shù)據(jù)依舊是飄忽不定的?！?。
課題由阿杰負(fù)責(zé)處理, 其內(nèi)容是鉆研某種炎癥因子于自身免疫病里所起的作用, 在整條實(shí)驗(yàn)線當(dāng)中, 最為關(guān)鍵的那一步操作屬運(yùn)用ELISA試劑盒, 而目的是檢測(cè)樣本里的蛋白濃度, 按常理推想, 針對(duì)這類實(shí)驗(yàn)他已然熟練到極致, 不存在更熟練的程度了, 然而此次卻遭遇阻礙, 進(jìn)展不下去了。
他起初認(rèn)定那屬于操作方面的小差錯(cuò), 于是再次進(jìn)行配液, 再次開展孵育, 再次開展洗板, 每一步均嚴(yán)格依照標(biāo)準(zhǔn)流程去做。然而, 怪就怪在, 標(biāo)準(zhǔn)品的OD值始終處于不穩(wěn)定的狀態(tài), 復(fù)孔之間的偏差大得超乎想象。那時(shí), 他覺得或許是試劑盒本身存在問題, 不過也沒深入去想, 隨后便又訂購了一批新的。
2026年3月12日, 新的試劑盒到貨, 阿杰特意提前解凍樣本、平衡樣本, 還重新清潔了一遍實(shí)驗(yàn)臺(tái), 他拉著實(shí)驗(yàn)室的小師妹一起操作, 目的是要確保每一步都有人核對(duì), 結(jié)果呢? 數(shù)據(jù)依舊讓人崩潰, 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的R2僅為0.89, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到發(fā)表文章的要求。
他針對(duì)那種挫敗感, 后來向我進(jìn)行了形容這樣描述: 這種挫敗感好比是, 你已然是依照地圖前行到達(dá)了目的地, 然而卻發(fā)覺地址是存在錯(cuò)誤狀況的。
ELISA試劑盒的批間差異到底有多大？
他阿杰開始尋思, 是不是自己所訂的試劑盒批次不太好, 他去查了查實(shí)驗(yàn)室以前的記錄, 查的過程發(fā)現(xiàn)同一品牌, 相同貨號(hào)前提下的試劑盒, 不同的批次檢測(cè)靈敏度確有不同, 他之前一直使用A公司的產(chǎn)品, 然而那次訂到的batch是生產(chǎn)日期比較早些時(shí)的, 剩余藥效期僅有三個(gè)月。
他前往詢問供應(yīng)商, 供應(yīng)商作出解釋稱, 在運(yùn)輸期間溫度出現(xiàn)波動(dòng), 這有可能對(duì)試劑活性產(chǎn)生影響。阿杰于此才發(fā)覺, 以前他壓根就沒留意過這種細(xì)節(jié)。隨后他更換了新一批次的試劑盒, 數(shù)據(jù)顯著穩(wěn)定起來。然而這件事情也讓他積攢了經(jīng)驗(yàn): 用于科研的 ELISA 試劑盒, 其批 間存在差異, 并非是小概率發(fā)生的事情, 挑選正確的批次, 跟挑選正確的產(chǎn)品一樣關(guān)鍵。
如何判斷科研ELISA試劑盒的靈敏度夠不夠？
當(dāng)數(shù)據(jù)處于穩(wěn)定狀態(tài)以后, 阿杰又遭遇到了新出現(xiàn)的問題, 那就是他所擁有的樣本濃度呈現(xiàn)出偏低的狀況, 處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的低端這個(gè)區(qū)域范圍之內(nèi), 檢測(cè)呈現(xiàn)出的信號(hào)十分微弱。他在查閱文獻(xiàn)的時(shí)候發(fā)覺, 存在著部分具有高靈敏度的試劑盒, 能夠檢測(cè)到皮克級(jí)別的蛋白, 然而他自己所使用的那一款試劑盒, 其檢測(cè)的下限是幾十皮克。
他對(duì)幾個(gè)品牌的說明書做了對(duì)比, 發(fā)覺靈敏度的標(biāo)注方式并非完全相同, 有的寫的是檢測(cè)下限, 有的寫的是定量下限, 兩者間存在著好幾倍的差距。他隨后挑選了一款標(biāo)注更為細(xì)致, 并且提供了實(shí)際樣本驗(yàn)證數(shù)據(jù)的試劑盒, 其靈敏度直接提高了三倍。他講道: “以往一直覺得選試劑盒就是去看價(jià)格與品牌, 其實(shí)真正應(yīng)當(dāng)看的是它可不可以解決你樣本的問題?！薄?/p>
樣本保存時(shí)間長了，會(huì)不會(huì)影響結(jié)果？
阿杰的那一批樣本，實(shí)則是去年年末采集所得, 被凍存于溫度為零下八十?dāng)z氏度的冰箱之中。他的實(shí)驗(yàn)始終未曾推進(jìn), 致使樣本放置了將近四個(gè)月之久。他查閱了相當(dāng)多的資料, 從中發(fā)覺在長期處于凍存狀態(tài)的樣本里, 目標(biāo)蛋白極有可能會(huì)出現(xiàn)降解情況, 特別是在經(jīng)過反復(fù)凍融之后。
他隨后特地進(jìn)行了一組對(duì)比, 將新鮮提煉的細(xì)胞上清、還有凍存樣本一同進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果新鮮樣本的檢測(cè)數(shù)值普遍相較于凍存樣本高出百分之十五至百分之二十, 此差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面是顯著, 他著手于在實(shí)驗(yàn)記錄里增添樣本保存時(shí)間以及凍融次數(shù)的備注, 并且提議實(shí)驗(yàn)室里的其他人也這么去做, 他講道: “科研ELISA試劑盒所能夠檢測(cè)出的蛋白濃度, 跟樣本本來的狀態(tài)關(guān)聯(lián)極大, 這一點(diǎn)極易被忽視。”。
實(shí)驗(yàn)時(shí)間太緊，怎么避免重復(fù)做？
那段時(shí)期阿杰壓力巨甚, 課題組匯報(bào)日期定于4月中旬, 他非得在那時(shí)間之先拿到可信數(shù)據(jù)。那時(shí)他將實(shí)驗(yàn)規(guī)劃得尤為緊密, 每日上午有加樣之舉、下午有顯色之為、傍晚還有讀板之行。然而有一回因洗板機(jī)出現(xiàn)堵孔狀況, 致使整板樣本歸于報(bào)廢, 他只好又等上一日。
日后他歸納出了一種方式: 每回開展實(shí)驗(yàn)之前先實(shí)施一回預(yù)實(shí)驗(yàn), 僅僅去跑標(biāo)準(zhǔn)品以及少數(shù)的幾個(gè)樣本, 確認(rèn)試劑盒狀況不存在問題之后再進(jìn)行批量上樣。如此這般雖說會(huì)多耗費(fèi)半天的時(shí)間, 然而相較于整板重新去做, 總體的時(shí)間反倒節(jié)省了。他還將試劑盒的說明書打印出來張貼在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的前方, 每次進(jìn)行操作之前對(duì)照著去看, 以此減少漏步的情況發(fā)生。
選擇ELISA試劑盒時(shí)，有哪些容易被忽略的點(diǎn)？
有過那次折騰后, 阿杰針對(duì)科研ELISA試劑盒挑選擁有了自身標(biāo)準(zhǔn), 他不再單單看品牌與價(jià)格與否, 而是會(huì)審慎要看產(chǎn)品說明書當(dāng)中的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù), 還要看樣本適用類型方面情況, 更得看是否存在獨(dú)立的質(zhì)控報(bào)告。他發(fā)覺某些試劑盒雖價(jià)格低廉, 然而適用于血清血漿者不一定能用于細(xì)胞上清, 緩沖體系有差異會(huì)致使基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生。
留意到，部分試劑盒于檢測(cè)復(fù)雜樣本之際, 會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合現(xiàn)象, 背景值偏高 , 之后換了一款經(jīng)由親和純化抗體優(yōu)化的產(chǎn)品, 背景干凈不少。稱: “乍一看皆為ELISA試劑盒, 然內(nèi)部工藝相差甚遠(yuǎn)?！?。
此時(shí), 阿杰所涉及的那批數(shù)據(jù)終于是好不容易整理完畢了, 文章也已然投遞出去了。前些天的時(shí)候, 他還發(fā)送消息講道, 要是當(dāng)初能夠更早一些更換試劑盒, 更早一些留意樣本保存條件的話，或許就用不著去熬過那長達(dá)三周的徹夜時(shí)段了。我在聽聞這番話語之后產(chǎn)生這樣的想法, 這些曾經(jīng)所經(jīng)歷過的坎坷, 講述出來說不定能夠?qū)φ迷陂_展實(shí)驗(yàn)的你起到幫助作用。畢竟, 實(shí)驗(yàn)所獲取的數(shù)據(jù)是不會(huì)說謊騙人的, 不過其前提在于, 你必須得率先挑選正確的工具才行。
