老張的實(shí)驗(yàn)困局，是不是也戳中了你？
在上周五的晚上十一點(diǎn)的那個(gè)時(shí)候, 我收到了老張打來的電話。在電話的另外一頭, 他發(fā)出的聲音是沙啞的狀態(tài), 同時(shí)帶著一股怎么都?jí)褐撇蛔〉臒┰昵榫w, 就這樣表達(dá)著: “又一次被廢掉了, 這一批次的樣品整個(gè)情況下全都白做了?！?。
我于生物公司做技術(shù)支撐之際結(jié)識(shí)的朋友是老張, 如今他于一家頭部藥企的早研部門擔(dān)任細(xì)胞生物學(xué)研究員。三月份時(shí), 他們組承接了一個(gè)重要的靶點(diǎn)驗(yàn)證項(xiàng)目, 老張所負(fù)責(zé)的是其中最為關(guān)鍵的那一環(huán), 也就是運(yùn)用生化檢測(cè)試劑盒, 對(duì)細(xì)胞裂解液里某一關(guān)鍵代謝物的濃度予以定量檢測(cè)。
項(xiàng)目時(shí)間緊迫，老張起初偷懶想較為省事, 徑直選用了在實(shí)驗(yàn)室常預(yù)備的通用試劑盒, 然而第一步標(biāo)準(zhǔn)曲線卻未能成功跑通, R平方值僅僅為0.89 , 他依據(jù)經(jīng)驗(yàn)重新對(duì)樣品進(jìn)行稀釋、更換緩沖液, 一番折騰了整個(gè)通宵, 但最終結(jié)果依舊與質(zhì)譜的參考數(shù)據(jù)無法對(duì)上。
“我都懷疑是不是自己手抖把細(xì)胞給污染了?！崩蠌埧嘈?。
生化檢測(cè)試劑盒到底怎么選才對(duì)？
其后, 我前往他的實(shí)驗(yàn)室, 進(jìn)行實(shí)地查看。老張所使用的, 是一款老款的比色法試劑盒, 那說明書之上記載的, 檢測(cè)范圍是從零點(diǎn)兒一到十微摩爾每升, 然而, 他樣品的實(shí)際濃度, 恰恰卡在零點(diǎn)兒零八強(qiáng), 近旁。
我說, 你這呈現(xiàn)出的是那種典型的選擇焦慮。就好比, 你去購置鞋子時(shí)的情況, 平常所穿鞋子尺碼是42碼。然而, 當(dāng)你處于要去跑馬拉松這個(gè)狀況的時(shí)候, 卻硬性買了一雙41碼的鞋子, 之后還責(zé)怪鞋子不合自己的腳。
生化檢測(cè)試劑盒所具有的核心邏輯總共就兩條, 其一為檢測(cè)原理得跟你的樣品基質(zhì)相匹配, 其二是線性范圍要將你的預(yù)期濃度區(qū)間給覆蓋住。就如同老張這般從事細(xì)胞裂解液制作的情況而言, 其中所含成分繁雜, 蛋白質(zhì)、鹽離子及去垢劑都極有可能對(duì)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。他所用的那款老款試劑盒運(yùn)用的是不具備特異性的顯色原理, 一旦遇到高蛋白樣品, 背景值會(huì)直接飆升至極高的程度。
換一個(gè)專業(yè)試劑盒，結(jié)果立馬不一樣
我建議他去嘗試一下我們公司新近推出的、針對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行優(yōu)化的生化檢測(cè)試劑盒, 這款試劑盒的配方特意添加了抗干擾穩(wěn)定劑, 其線性范圍拓展到了0.01至50微摩爾每升, 并且與之配套的校準(zhǔn)品是經(jīng)過質(zhì)譜定值的。
老張?zhí)幱趯⑿艑⒁傻臓顟B(tài)之中, 然而依舊取了一盒回去進(jìn)行試驗(yàn)。他依據(jù)說明書的要求, 以試劑盒所附帶出現(xiàn)的稀釋液來完成對(duì)樣品的處理, 在設(shè)備上機(jī)的前期階段又額外增加了一個(gè)樣品空白對(duì)照的操作施行。在這一輪, 標(biāo)準(zhǔn)曲線R平方值徑直達(dá)到了0.998, 三個(gè)平行孔的變異系數(shù)僅僅為2.1%。
老張?jiān)谖⑿派习l(fā)了一個(gè)笑哭的表情, 說道: “哎呀媽, 居然不是我手有毛病, 而是工具不合適?！?。
第二次踩坑：操作細(xì)節(jié)才是隱藏的大坑
但是呢, 故事并沒有就此結(jié)束。三天過后, 老張?jiān)俅螕艽蛄穗娫? 這一回, 他的語氣顯得更加急切了, 老張說道: “更換了屬于你的試劑盒之后, 出現(xiàn)了幾個(gè)呈現(xiàn)異常狀態(tài)的值, 有兩組數(shù)據(jù)的重復(fù)性表現(xiàn)得非常差。”。
是我讓他把那實(shí)驗(yàn)記錄通過拍照的方式發(fā)送過來的。當(dāng)我一看的時(shí)候, 就發(fā)現(xiàn)存在問題了——在他進(jìn)行加樣操作的時(shí)候, 將試劑盒里面的反應(yīng)液A以及反應(yīng)液B的順序給弄反了。并且呢, 他因?yàn)橄胍s時(shí)間, 在加完試劑之后并沒有充分地進(jìn)行混勻操作, 而是直接就去上機(jī)讀數(shù)了。
“老張，你這是在用炒菜的方式做實(shí)驗(yàn)啊。”我哭笑不得。
生化檢測(cè)試劑盒的操作流程當(dāng)中, 加樣順序乃是經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證的了。況且孵育時(shí)間同樣是經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證而定的。哪怕僅僅只差一分鐘, 又或者混勻的時(shí)候并不徹底。如此這般, 肯定就會(huì)致使局部反應(yīng)不均勻。既然局部反應(yīng)不均勻。那么所出來的吸光度值必然飄忽不定。更何況他所出現(xiàn)的那個(gè)異常值。那是由于加樣槍頭沒有更換。進(jìn)而帶入了上一管的殘留成分所致的。
試劑盒不是萬能，但用對(duì)方法就是神器
老張?jiān)俣戎谱髁艘慌? 此次我特地前往他的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行監(jiān)督, 始于樣品的前期處理, 各步驟皆依照說明書來執(zhí)行, 于冰面上開展操作，加樣之后以低速振蕩30秒鐘, 在37攝氏度下孵育剛好15分鐘, 隨后即刻放置到酶標(biāo)儀上。
結(jié)果呈現(xiàn)出來之后, 老張就盯著那數(shù)據(jù)瞧了好長(zhǎng)一陣子, 忽然間拍下了桌子一把, 說道: “線性度實(shí)在是非同一般得好, 跟質(zhì)譜進(jìn)行比對(duì)所產(chǎn)生的偏差達(dá)不到百分之五?！?。
他此時(shí)每回開展實(shí)驗(yàn)之前, 都會(huì)率先將生化檢測(cè)試劑盒的說明書由頭至尾閱覽一番, 借助熒光筆標(biāo)記出要緊步驟, 張貼于實(shí)驗(yàn)臺(tái)跟前。上個(gè)月他們小組的項(xiàng)目階段性匯報(bào), 他的那一部分的數(shù)據(jù)質(zhì)量在全場(chǎng)是最為上乘的, 總監(jiān)特地詢問他運(yùn)用了何種辦法。
老張說：“哪有什么方法，就是把試劑盒當(dāng)回事。”
寫在最后
實(shí)事求是講, 市面上的生化檢測(cè)試劑盒種類繁多, 價(jià)格范圍在幾百至幾千之間, 然而真正適配自身的僅有寥寥幾款。挑選試劑盒恰似尋覓伴侶, 不能夠僅僅著眼于宣傳頁所呈現(xiàn)的參數(shù), 而要考量其與你所擁有樣品之間的兼容性, 考量其在面對(duì)干擾時(shí)的抵抗能力, 考量其在操作過程中的容錯(cuò)概率。
要是你如同老張那般, 遭受過數(shù)據(jù)重復(fù)性欠佳、標(biāo)準(zhǔn)曲線無法順利跑出、異常值不斷反復(fù)出現(xiàn)這類問題的折騰, 不妨回過頭去查驗(yàn)一下手中的試劑盒。有時(shí)并非是你能力不足, 而是你沒有選對(duì)工具。
今年四月份, 老張所在的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)部對(duì)比測(cè)試, 針對(duì)同一批樣品, 運(yùn)用三個(gè)不同品牌的生化檢測(cè)試劑盒開展平行試驗(yàn)。最終的測(cè)試結(jié)果顯示, 僅老張所使用的那款試劑盒, 在檢測(cè)限、精密度以及回收率這三個(gè)維度上均實(shí)現(xiàn)完全達(dá)標(biāo)。而其他兩款試劑盒的表現(xiàn)各不相同, 其中一款在低濃度段直接無法得出檢測(cè)結(jié)果, 另一款的回收率僅為72%。
只有工具正確無誤, 實(shí)驗(yàn)才能夠順利開展。唯有數(shù)據(jù)真實(shí)可靠, 結(jié)論才能夠站得住腳。就是這么個(gè)道理, 老張耗費(fèi)了三個(gè)月的時(shí)間才最終徹徹底底透徹明晰地搞清楚弄明白。但愿你不需要走上那么多種多樣數(shù)量眾多的彎路。
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