有個(gè)被我稱作朋友的人是王磊, 他于一家處在蘇州的生物科技公司擔(dān)任研發(fā)主管, 其所主要從事的是基因檢測(cè)這個(gè)領(lǐng)域, 他從事這一行業(yè)快要達(dá)到十年時(shí)間了, 平常與他打交道最為頻繁的便是各類PCR試劑盒, 在相關(guān)圈子當(dāng)中的人都了解, 對(duì)于PCR這般事物而言, 講它簡(jiǎn)單的時(shí)候它確實(shí)簡(jiǎn)單, 然而講它復(fù)雜的時(shí)候, 是能夠讓人流露出想要摔試管這般想法的。
去年夏天的時(shí)候, 王磊承接了一個(gè)規(guī)模較大的單子, 是為一家從事種豬養(yǎng)殖的豬場(chǎng)開展非洲豬瘟的大量篩查工作。甲方催促的節(jié)奏很緊湊, 表明三天之內(nèi)必須得出具相應(yīng)結(jié)果, 不然種豬的調(diào)運(yùn)事宜就會(huì)失敗。王磊沒有說(shuō)任何多余的話, 帶領(lǐng)著團(tuán)隊(duì)即刻就著手開展工作。
PCR定量結(jié)果總是飄，問題出在哪？
就在前兩天的時(shí)候, 所有情況進(jìn)展得極為順當(dāng)順?biāo)?。樣本被進(jìn)行提取, 然后是擴(kuò)增, 接著得出數(shù)據(jù), 整個(gè)流程開展得如同按照教科書那般精準(zhǔn)無(wú)誤。然而到了第三天, 王磊一直注視著電腦屏幕上所顯示的CT值, 他的臉色變得愈發(fā)難看。針對(duì)同一個(gè)樣本, 在上午的時(shí)候跑出來(lái)的最終結(jié)果呈現(xiàn)為陽(yáng)性, 而到了下午, 更換了另外一個(gè)試劑盒再次進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果卻直接轉(zhuǎn)變?yōu)槿蹶?yáng)性, 甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果的情況都存在。他吩咐手下把原始的數(shù)據(jù)給調(diào)取出來(lái), 進(jìn)行反復(fù)地仔細(xì)核對(duì), 最后發(fā)現(xiàn)其重復(fù)性糟糕得簡(jiǎn)直離譜至極。
將小劉的詢問改寫為: “磊哥, 咱們的提取步驟會(huì)不會(huì)存在問題? ”新來(lái)的小劉帶著怯意問道。王磊搖了搖頭, 提取流程是他親自盯著的, 采用磁珠法純化, 整個(gè)過程沒有受到污染了。他又懷疑是機(jī)器出故障，連夜晚找工程師檢查熒光定量PCR儀, 設(shè)備全部是正常的。問題究竟出在什么地方?
網(wǎng)上有人吐槽, 講某些PCR定量試劑盒的配方穩(wěn)定性欠佳, 批間差異頗大。王磊想起此事, 翻出倉(cāng)庫(kù)剩余的試劑盒, 認(rèn)真查看批號(hào)與有效期, 皆是三個(gè)月內(nèi)的新貨。他隨手取了一盒, 拆開核對(duì)組分, 猛然發(fā)覺稀釋液里有細(xì)微的沉淀物。
如何選擇靠譜的PCR檢測(cè)試劑盒？
王磊察覺到, 或許是試劑盒自身的質(zhì)量存在著高低不一的狀況, 他撥通電話給圈子里的一位老哥, 這位老哥在廣東從事第三方檢測(cè)工作, 具備豐富的經(jīng)驗(yàn)。老哥傾聽完他的敘述后, 直接說(shuō)道: “你這家伙是不是貪圖便宜, 購(gòu)買了小廠家生產(chǎn)的散裝貨品呢? 定量PCR這個(gè)事物, 其關(guān)鍵在于酶與引物的匹配程度。你所使用的那個(gè)品牌, 我在去年就遭遇過問題, 批次之間的差異大得驚人, 后來(lái)就全部更換掉了?！?。
王磊這時(shí)才回憶起來(lái), 這批試劑盒是采購(gòu)部臨時(shí)更換的供應(yīng)商, 聲稱價(jià)格便宜三成。他那時(shí)忙于趕項(xiàng)目, 也未曾仔細(xì)查看。如今可好, 數(shù)據(jù)無(wú)法使用, 工期將會(huì)延誤, 甲方那邊已然打電話前來(lái)催促了。
他馬上吩咐采購(gòu)再次購(gòu)置了一批在業(yè)內(nèi)被大家一致認(rèn)為口碑優(yōu)良的PCR定量試劑盒, 其組分當(dāng)中添加了經(jīng)過優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)以及熱啟動(dòng)酶, 聽說(shuō)能夠切實(shí)有效地減少非特異性擴(kuò)增。貨物送達(dá)之后, 王磊親自帶領(lǐng)著團(tuán)隊(duì)再度進(jìn)行了一遍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。這一回, 對(duì)于同一個(gè)樣本, 三次重復(fù)所得到的CT值相互之間相差不足0.5, 重復(fù)性一下子就提升起來(lái)了。
PCR定量試劑盒的保存條件影響有多大？
數(shù)據(jù)處于穩(wěn)定狀態(tài)了, 然而王磊卻沒敢有絲毫的疏忽大意。他認(rèn)真地查看了新試劑盒所附帶的說(shuō)明書, 那上面清晰明確地進(jìn)行了記載: 要是需要長(zhǎng)期保存的話, 必須處于零下二十?dāng)z氏度以下的環(huán)境, 同時(shí)要防止出現(xiàn)反復(fù)凍融的情況。他回想起了舊試劑盒的存放具體情形——倉(cāng)庫(kù)里面的冰箱總是被眾人隨意地進(jìn)行開關(guān)操作, 致使溫度一會(huì)兒高一會(huì)兒低, 偶爾早上查看時(shí)顯示為零下十八攝氏度, 可到下午的時(shí)候就已經(jīng)攀升到零下十?dāng)z氏度了。在這樣的一種環(huán)境狀況之下, 酶的活性以及引物的質(zhì)量必然會(huì)出現(xiàn)降低的情況的。
他還查閱了不少行業(yè)方面的資料, 發(fā)覺好多實(shí)驗(yàn)室于PCR定量進(jìn)程當(dāng)中出了差錯(cuò), 并非是操作方面存在問題, 而是試劑盒的儲(chǔ)存以及使用的細(xì)微之處沒有落實(shí)到位。像是PCR定量試劑盒里頭的熒光染料, 對(duì)光線敏感, 長(zhǎng)時(shí)間處于強(qiáng)光之下會(huì)發(fā)生淬滅現(xiàn)象, 致使熒光信號(hào)變?nèi)? CT值自然而然就出現(xiàn)波動(dòng)了。
王磊特意為團(tuán)隊(duì)開展啦一次培訓(xùn), 提出要求, 所有試劑盒一旦開封之后, 就必須進(jìn)行分裝保存, 以此來(lái)避免出現(xiàn)反復(fù)凍融的情況。而且, 他還購(gòu)置了一批避光盒, 將試劑盒放置到里面, 以此確保每次在使用之前, 都要去檢查溫度紀(jì)錄, 這些細(xì)節(jié)瞅著是挺瑣碎的, 然而它卻直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
不同樣本類型對(duì)PCR定量性能有影響嗎？
那個(gè)項(xiàng)目最終順利地呈現(xiàn)出交付的大結(jié)局, 甲方對(duì)于其結(jié)果抱以十分滿意的態(tài)度。然而王磊并未在達(dá)成如此狀況之后就此停止手中的行動(dòng)。他腦海之中不停地思索著, 究竟是出于何種緣由, 致使同樣一款PCR 定量試劑盒, 于不同的樣本類型之上所展示出來(lái)的表現(xiàn)差異會(huì)如此巨大呢? 舉例來(lái)說(shuō), 像血清樣本以及糞便樣本這兩種, 經(jīng)過提取之后所獲得的核酸純度竟然是不一樣的, 并且其中殘留下來(lái)的雜質(zhì)竟然會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生阻礙抑制的作用。
他特意進(jìn)行了一組對(duì)比實(shí)驗(yàn), 這組實(shí)驗(yàn)中分別用到了血液, 還用到了組織勻漿, 另外也用到了拭子樣本, 這些樣本搭配的是同一一款PCR定量試劑盒, 目的是要看擴(kuò)增效率。后來(lái)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 拭子樣本所呈現(xiàn)的擴(kuò)增曲線最為好看, 而組織勻漿樣本要是提取得不夠徹底, 就容易出現(xiàn)假陰性的情況。血液樣本呢, 是由于其中含有血紅蛋白等抑制物, 所以需要搭配專門的去抑制劑試劑盒。
王磊將這個(gè)經(jīng)驗(yàn)撰寫成了內(nèi)部操作手冊(cè), 接著把它分發(fā)給了團(tuán)隊(duì)。隨后，在一期一次的行業(yè)交流會(huì)上, 他提到了這個(gè)案例, 臺(tái)下不止幾個(gè)的人點(diǎn)頭, 紛紛表明碰到過相似的問題, 只是不曉得怎樣去排查。
熒光定量PCR試劑盒的靈敏度怎么驗(yàn)證？
今年三月份的時(shí)候, 王磊所在的公司著要去申報(bào)一個(gè)省級(jí)科研項(xiàng)目, 這個(gè)項(xiàng)目是需要提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的。其中存在一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo), 此指標(biāo)就是PCR定量試劑盒的靈敏度, 而靈敏度也就是最低檢測(cè)限。王磊把之前已經(jīng)驗(yàn)證過的數(shù)據(jù)拿了出來(lái), 卻發(fā)現(xiàn)有一些低拷貝樣本的檢出率呈現(xiàn)不穩(wěn)定的狀況。
他查找了最新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn), 發(fā)覺靈敏度驗(yàn)證不能僅看理論值, 得用實(shí)際樣本做梯度稀釋測(cè)定。王磊帶領(lǐng)著團(tuán)隊(duì), 將標(biāo)準(zhǔn)品從高濃度一直稀釋到理論上的單拷貝級(jí)別, 接著用PCR定量試劑盒逐個(gè)檢測(cè)。多次做了五次實(shí)驗(yàn), 明確了這款試劑盒在實(shí)際操作里的下限。
他另外發(fā)現(xiàn), 靈敏度與試劑盒當(dāng)中聚合酶的保真度緊密相關(guān)。存在某些酶在高循環(huán)數(shù)情形下易于失活, 致使低拷貝樣本無(wú)法被擴(kuò)增出來(lái)。王磊毅然決然更換了另一款具備高保真聚合酶的PCR定量試劑盒, 最終靈敏度提高了將近一個(gè)數(shù)量級(jí), 順利通過了項(xiàng)目評(píng)審。
如今, 王磊于每次采購(gòu)之前, 都會(huì)率先開展小批量驗(yàn)證, 對(duì)批間差以及靈敏度予以測(cè)試, 而后才判定是否進(jìn)行大批量進(jìn)貨。他時(shí)常跟同行講, PCR定量試劑盒究竟好不好, 并非能夠僅僅依據(jù)宣傳來(lái)判斷, 而是必須自己動(dòng)手去嘗試, 特別是那些細(xì)節(jié)參數(shù), 其直接決定著你所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒ψ龀鰜?lái)。
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