與老張相識(shí)已歷經(jīng)七八年之久, 他于本地一家從事生物業(yè)務(wù)的公司擔(dān)任研發(fā)主管一職, 其主要職責(zé)在于負(fù)責(zé)與分子檢測相關(guān)聯(lián)的各項(xiàng)項(xiàng)目。雖被稱作主管, 實(shí)則不過是個(gè)“光桿司令”罷了, 僅帶領(lǐng)著兩名剛剛畢業(yè)的實(shí)習(xí)生開展工作, 自樣本處理這一環(huán)節(jié)直至數(shù)據(jù)分析階段, 統(tǒng)統(tǒng)都需由他自己密切留意把關(guān)。
去年十一月, 他們公司承接一新項(xiàng)目, 需就一批環(huán)境樣本開展病原微生物篩查。此項(xiàng)目時(shí)間緊迫、任務(wù)繁重, 甲方僅給予兩周窗口期。老張?jiān)靖杏X問題不大, 畢竟其從事實(shí)時(shí)熒光定量PCR（即qPCR）近十年, 儀器操作、試劑配比、程序設(shè)置這些, 閉著眼均可完成。
可偏偏就是這次，讓他栽了個(gè)大跟頭。
實(shí)則事情起始極為簡易且平常。于項(xiàng)目開啟過后的第三天之際, 老張察覺到一樁異樣狀況, 即: 有著相同的反應(yīng)體系, 還有相同的模板, 然而重復(fù)去跑了三板之后其最終結(jié)果卻皆不相同。Ct值之間存在的差異大到超乎常理, 從23跳躍至28這個(gè)數(shù)值, 甚至有幾孔根本就連信號(hào)都未曾顯現(xiàn)出來。老張起初時(shí)候認(rèn)為僅僅是加樣環(huán)節(jié)出現(xiàn)了差錯(cuò), 遂讓實(shí)習(xí)生再次去配置了一板試劑, 到頭來呈現(xiàn)出來的結(jié)果依舊是相同的那般情況。
那天晚上, 他給我打電話, 其語氣之中帶著顯著的不耐煩, 說道: “這東西我已然做了這么多年, 可從來都未曾碰到過這種事。你講是不是儀器出現(xiàn)問題了呢? ”我向他提議, 先別著急著去懷疑設(shè)備, 應(yīng)先依循反應(yīng)體系以及引物探針的角度去排查一番。
掛斷電話之后, 老張切實(shí)靜下心來思索了一番。次日清晨, 他抵達(dá)了實(shí)驗(yàn)室, 將引物以及探針的序列再次進(jìn)行了比對, 發(fā)覺其中有一對引物的退火溫度計(jì)算結(jié)果偏低了三四度。該偏差在以往的普通定性PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)或許影響不太顯著, 然而在實(shí)時(shí)熒光定量PCR這種需要精準(zhǔn)擴(kuò)增的情形下, 會(huì)直接致使擴(kuò)增效率降低, 甚至出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
他急忙再度優(yōu)化了退火溫度, 隨后又調(diào)制了引物濃度比例, 接著又再次做了一回試驗(yàn)。此次Ct值穩(wěn)定了許多, 重復(fù)性也提升了。老張長出了一口氣, 認(rèn)為問題已然解決。然而出乎意料的是, 接下來又出現(xiàn)了新狀況。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線為什么總是不理想
老張?jiān)俅瓮瓿梢惠唽?shí)驗(yàn)后, 擴(kuò)增曲線雖說穩(wěn)定了, 然而曲線的S型特征并不夠顯著, 平臺(tái)期的熒光信號(hào)強(qiáng)度處于偏低狀態(tài), 這致使他再度為此頭疼不已。需要明確的是, 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)里, 擴(kuò)增曲線的形態(tài)與數(shù)據(jù)的可靠性直接相關(guān)聯(lián)。要是曲線的形態(tài)不佳, 在后期進(jìn)行相對定量時(shí), 所計(jì)算得出的表達(dá)量差異或許會(huì)全然不準(zhǔn)確。
他翻閱過許多文獻(xiàn), 又同幾位同行進(jìn)行了廣泛交流, 最終發(fā)覺問題的根源在于模板質(zhì)量。那一批環(huán)境樣本的前處理做得并不夠徹底, 樣本之中殘留了一些抑制物, 對聚合酶的活性產(chǎn)生了影響。老張重新改進(jìn)了核酸提取的流程, 增加了洗滌的次數(shù), 并且特意額外添加了內(nèi)參對照用以監(jiān)控提取效率。修改完成之后再次上機(jī), 擴(kuò)增曲線終于變得美觀了。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參該怎么選
老張于優(yōu)化模板質(zhì)量進(jìn)程當(dāng)中, 還發(fā)覺了有一個(gè)更深層次的問題, 即他們先前使用的內(nèi)參基因?qū)嶋H上并不適配這批樣本, 那些環(huán)境樣本源自不同地點(diǎn), 樣本基質(zhì)有著很大差異, 有的含腐殖酸較多, 有的含礦物質(zhì)較多, 同一個(gè)內(nèi)參基因于不同樣本里的表達(dá)水平波動(dòng)頗為明顯。
后來, 他耗費(fèi)三天時(shí)日, 于這批樣本之中進(jìn)行了三個(gè)常見內(nèi)參基因的預(yù)實(shí)驗(yàn), 借助GeNorm算法對它們的穩(wěn)定性予以評估, 最終挑選出一個(gè)表現(xiàn)最為穩(wěn)定的。如此一改, 后續(xù)的相對定量結(jié)果方才真正具備了可比性。老張隨后向我感慨表示, 眾多人員開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR之際, 常常忽視內(nèi)參選擇這一環(huán)節(jié), 認(rèn)為隨意選取一個(gè)常用的即可, 實(shí)則這是一個(gè)極大的陷阱。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析到底怎么做才靠譜
做完實(shí)驗(yàn)之后, 老張所面對的數(shù)據(jù)量并非不大。數(shù)量為幾十個(gè)的樣本, 且每個(gè)樣本都存在三個(gè)復(fù)孔, 除此之外還有標(biāo)準(zhǔn)曲線、陰性對照以及陽性對照, 僅僅是整理這些數(shù)據(jù), 便耗費(fèi)了長達(dá)半天的時(shí)間。他先前一直慣于手動(dòng)在Excel里計(jì)算Ct值, 而后再去計(jì)算相對表達(dá)量, 然而此次樣本數(shù)量眾多, 所需考量的條件繁雜, 依靠手動(dòng)操作實(shí)在極其容易出現(xiàn)差錯(cuò)。
存在一位實(shí)習(xí)生, 向他提出建議, 建議其使用專門的軟件展開分析, 老張起初的時(shí)候, 還認(rèn)為自己依靠手動(dòng)計(jì)算會(huì)更加放心, 隨后嘗試了一下軟件, 發(fā)覺的確便利了許多, 軟件能夠自動(dòng)識(shí)別擴(kuò)增曲線, 能夠剔除異常值, 并且還能夠直接導(dǎo)出相對定量結(jié)果, 老張稱, 早已經(jīng)知曉如此省事, 他早就應(yīng)該使用了。
然而, 他也進(jìn)行了一番提醒, 軟件盡管具備便利性, 可是關(guān)鍵參數(shù)的設(shè)置仍舊需要自己去把控, 舉例來說, 基線閾值的設(shè)定, 擴(kuò)增效率的校正, 倘若這些地方出現(xiàn)設(shè)置錯(cuò)誤的情況, 再好的軟件也是無法拯救的。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的常見誤區(qū)有哪些
做下來這次項(xiàng)目的老張, 踩了好些坑, 也積攢了好些經(jīng)驗(yàn)。他跟我講, 實(shí)際上好多做實(shí)時(shí)熒光定量PCR的人, 最容易犯的錯(cuò)誤便是“太自信”?？偸钦J(rèn)為流程簡單, 操作熟悉, 就不去認(rèn)真驗(yàn)證每一步的細(xì)節(jié)。
例如引物設(shè)計(jì), 不少人運(yùn)用通用設(shè)計(jì)軟件運(yùn)行一番后, 自認(rèn)為沒問題便徑直采用, 卻不進(jìn)行熔解曲線驗(yàn)證, 后果是一旦開展實(shí)驗(yàn), 才發(fā)覺存在引物二聚體情形, 或者出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增狀況。再比方標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作, 有些人僅僅制作一個(gè)稀釋梯度, 抑或甚至不做重復(fù)操作, 如此這般的標(biāo)準(zhǔn)曲線根本無法呈現(xiàn)出真實(shí)的擴(kuò)增效率。
存在一個(gè)易于被忽視的要點(diǎn)關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性, 老張往昔開展實(shí)驗(yàn)時(shí), 針對一個(gè)條件僅運(yùn)行一次便獲取了結(jié)果。然而, 此次他變得謹(jǐn)慎了, 針對每個(gè)條件最少進(jìn)行三次生物學(xué)方面的重復(fù), 三次作為技術(shù)方面的重復(fù)之舉。盡管工作量顯著增大了許多, 但數(shù)據(jù)的可靠性明顯得以提升了。
做實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)前一定要檢查哪些環(huán)節(jié)
現(xiàn)在老張每次在做實(shí)驗(yàn)之前, 都會(huì)花費(fèi)二十分鐘去做一個(gè)簡單的檢查清單。那模板的濃度達(dá)不達(dá)標(biāo), 純度又達(dá)不達(dá)標(biāo), 引物的濃度準(zhǔn)不準(zhǔn)確, 探針的濃度準(zhǔn)不準(zhǔn)確, 反應(yīng)液的配制均不均勻, 這些看上去瑣碎的步驟, 實(shí)際上直接就決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。
他格外留意檢查耗材質(zhì)量, 某些價(jià)格低廉的八連管、封板膜, 其透光性欠佳, 或密封性不好, 于實(shí)時(shí)熒光定量PCR這類高靈敏度實(shí)驗(yàn)中, 則極易致使熒光信號(hào)產(chǎn)生波動(dòng), 或因出現(xiàn)膜被液體浸濕狀態(tài)時(shí)而導(dǎo)致體積發(fā)生變化, 進(jìn)而直接對擴(kuò)增效率造成影響。
老張講道, 他以前一直以為這些屬于“小問題”, 如今才弄明白, 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)不怕遭遇麻煩, 只怕貪圖省事。貪圖省事所帶來的結(jié)果大概率是返工, 這不僅耗費(fèi)時(shí)間還有精力, 而且數(shù)據(jù)質(zhì)量還得不到保障。
在整個(gè)項(xiàng)目進(jìn)程中, 老張成功地將那批環(huán)境樣本的篩查任務(wù)予以順利完成, 甲方對此也呈現(xiàn)出頗為滿意的狀態(tài), 隨后他于公司內(nèi)部開展了一次技術(shù)內(nèi)容的分享活動(dòng), 把自身在此次過程中所遭遇的困難以及歸納總結(jié)形成的經(jīng)驗(yàn)均詳盡講述出來, 眾多參與其中傾聽的同事在聽聞此番講述之后紛紛表示, 以往存在諸多未曾留意到的細(xì)微之處, 今后針對實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)必然會(huì)更加謹(jǐn)慎用心。
咱先來說老張跟俺講的事兒, 就說做實(shí)驗(yàn)這話, 那可是越做越覺著自個(gè)兒啥都不懂。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 這看著像是個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù), 可真要把數(shù)據(jù)做得精準(zhǔn)、做得穩(wěn)定, 那背后要花的心思可一點(diǎn)都不少呢。
