在生物技術(shù)這個(gè)圈子內(nèi), 我結(jié)識(shí)阿梁已快十年, 他是我的老朋友, 他和我相比大兩歲, 其性格沉穩(wěn), 進(jìn)行做事時(shí)一絲不茍, 他本科念的是生物工程, 碩士畢業(yè)之后直接進(jìn)入一家從事抗體藥物的公司, 負(fù)責(zé)細(xì)胞培養(yǎng)這一方面, 他總是自我調(diào)侃講, 自己就是個(gè)從事細(xì)胞培養(yǎng)的人, 然而這工作倘若真要出色完成, 沒(méi)有三五年的磨礪, 根本無(wú)法勝任, 我平常碰到細(xì)胞培養(yǎng)方面的難題, 最早想到的就是給他致電。
去年夏季的時(shí)候, 我邀約阿梁去用餐。那段時(shí)間我正被自己手頭那幾個(gè)實(shí)驗(yàn)搞得疲憊不堪, 細(xì)胞老是生長(zhǎng)得不理想, 要么遭受污染, 要么狀態(tài)不佳, 數(shù)據(jù)根本沒(méi)辦法使用。阿梁聽(tīng)完我的抱怨, 微笑著說(shuō)他自己也剛剛遭遇了一個(gè)嚴(yán)重挫折。
2025 年 5 月便開(kāi)啟了相關(guān)事情, 阿梁所在的團(tuán)隊(duì)承接了一個(gè)新項(xiàng)目, 需于兩個(gè)月內(nèi)做完一批具有高密度的細(xì)胞培養(yǎng), 以此來(lái)用于后續(xù)的蛋白表達(dá)驗(yàn)證, 時(shí)間緊迫, 任務(wù)繁重, 阿梁起初是頗具信心的, 畢竟他在該行業(yè)已然工作了六年, 常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)流程就算閉著眼睛也能夠完成, 像培養(yǎng)基的配比、傳代的時(shí)機(jī)以及培養(yǎng)箱的參數(shù)等, 他都已經(jīng)牢記在心。
細(xì)胞培養(yǎng)第一步，為什么總是污染
阿梁講, 那批細(xì)胞才剛復(fù)蘇之際, 瞅著狀態(tài)挺好。他依照老習(xí)慣, 采用了先前始終在用的培養(yǎng)基以及血清, 操作臺(tái)實(shí)施了嚴(yán)格消毒, 所有器皿均預(yù)先進(jìn)行滅菌。然而第一批培養(yǎng)至第三天時(shí), 在顯微鏡下就呈現(xiàn)出異常狀況。在幾個(gè)培養(yǎng)瓶里頭, 細(xì)胞周邊多出了一些細(xì)小的、持續(xù)晃動(dòng)的顆粒, 有的地方還出現(xiàn)了渾濁的團(tuán)塊。
當(dāng)時(shí), 他腦袋瞬間嗡的一下, 其第一反應(yīng)便是覺(jué)得被污染了。細(xì)菌、真菌以及支原體, 在細(xì)胞培養(yǎng)這個(gè)范疇里, 這些詞匯宛如“鬼故事”一般, 誰(shuí)都不愿遭遇。阿梁趕忙將所有存有疑點(diǎn)的培養(yǎng)瓶都進(jìn)行隔離, 隨后重新進(jìn)行取樣檢測(cè)。待結(jié)果出來(lái)之后, 他不禁倒吸一口涼氣, 竟是支原體污染。
“支原體此物堪稱最為煩人的存在, 它并非如那般細(xì)菌一樣, 能夠一眼便清晰地看出來(lái), 在諸多時(shí)候, 細(xì)胞依然是可以生長(zhǎng)的, 然而其狀態(tài)卻是在逐漸地變差, 就連數(shù)據(jù)亦是飄忽不定的。”阿梁輕抿了一口啤酒, 眉頭緊皺著說(shuō)道, “我在那時(shí)候, 每一天都緊緊地盯著顯微鏡去看, 幾乎都快要形成心理陰影了。后來(lái)我才終于意識(shí)到, 或許是我所使用的那一批血清存在著問(wèn)題, 抑或是在操作的過(guò)程當(dāng)中, 哪一個(gè)微小的細(xì)節(jié)未曾留意到?！?。
他向我講述, 細(xì)胞培養(yǎng)這項(xiàng)工作, 較量的便是細(xì)節(jié)。污染的源頭不外乎這幾個(gè)方面: 操作的環(huán)境, 培養(yǎng)基以及血清, 器皿和耗材, 還有操作者自身。許多人認(rèn)為在超凈臺(tái)里噴灑酒精便大功告成, 實(shí)際上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于無(wú)菌環(huán)境的要求, 較大多數(shù)人所想象的嚴(yán)苛許多。那次之后, 阿梁將整個(gè)操作流程再次有條不紊地整理了一回, 甚至把培養(yǎng)箱的隔層拆卸下來(lái)進(jìn)行徹底的清洗并滅菌, 又更換了一批全新的培養(yǎng)基和血清, 這才好不容易穩(wěn)定住了局面。
細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)差，到底該從哪里找原因
費(fèi)勁千辛萬(wàn)苦好不容易才將污染的問(wèn)題給控制住了, 此時(shí)還沒(méi)等阿梁能夠舒緩一下緊張的氣息, 新出現(xiàn)的難題麻煩便又再次降臨了。那一批細(xì)胞盡管沒(méi)有再次出現(xiàn)污染的情況, 然而其生長(zhǎng)的速度卻格外緩慢, 并且細(xì)胞呈現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)也是不正確的。正常情況下進(jìn)行貼壁的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是呈現(xiàn)舒展?fàn)顟B(tài)的, 并且其邊緣是棱角清晰分明的, 可是在他當(dāng)時(shí)所看到的那些細(xì)胞看起來(lái)卻是又小又呈現(xiàn)圓形的樣子, 其中還有一部分是漂浮在培養(yǎng)液當(dāng)中的, 活生生地就好像是處于一種“營(yíng)養(yǎng)缺乏不良”的狀態(tài)。
阿梁嘗試了好些種辦法, 調(diào)整血清的濃度, 更換培養(yǎng)基的品牌, 縮短傳代的周期, 降低培養(yǎng)的溫度, 能想到的法子都試過(guò)一回, 然而收效頗為微小。那段日子他壓力極大, 項(xiàng)目的進(jìn)度已然落后, 領(lǐng)導(dǎo)每日催促, 組里的技術(shù)員也隨之緊張起來(lái)。阿梁講, 他有一晚待在實(shí)驗(yàn)室中, 對(duì)著顯微鏡發(fā)呆, 覺(jué)得自己好似一只無(wú)頭蒼蠅。
阿梁眼睛亮了一下, 說(shuō)道, 后來(lái)有一位在細(xì)胞培養(yǎng)方面時(shí)間持續(xù)更久的前輩給了我一句指點(diǎn), 他講, 你僅僅只是盯著細(xì)胞自身去看是沒(méi)有作用的, 必須要朝著上游方向去探尋原因, 細(xì)胞呈現(xiàn)出的狀態(tài)不佳, 在很多情形下是作為源頭的種子細(xì)胞自身就已經(jīng)出現(xiàn)了問(wèn)題。
使阿梁一下子明白的是這句話, 他找出這批細(xì)胞的凍存記錄, 發(fā)覺(jué)當(dāng)初凍存時(shí), 細(xì)胞密度寫得不清楚, 他復(fù)蘇后沒(méi)做更精細(xì)的活率檢測(cè), 直接依照經(jīng)驗(yàn)傳了一代便開(kāi)始鋪板, 他趕忙重新復(fù)蘇了一批新的種子細(xì)胞, 這次每一步都嚴(yán)格地記錄, 復(fù)蘇后先進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色, 活率低于90%的絕對(duì)不使用, 同時(shí), 他還對(duì)培養(yǎng)基的配方做了調(diào)整, 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里額外添加了谷氨酰胺和丙酮酸鈉, 給細(xì)胞補(bǔ)充能量。
誠(chéng)然, 細(xì)胞的狀態(tài)以肉眼能夠察覺(jué)到的態(tài)勢(shì)明顯地好轉(zhuǎn)起來(lái)。直至第四天, 培養(yǎng)瓶當(dāng)中的細(xì)胞已然生長(zhǎng)得極為密集, 鋪展成為均勻的單層, 于顯微鏡下觀察過(guò)去, 其形態(tài)飽滿, 邊界明晰, 恰似一片規(guī)整的稻田。阿梁于此方才長(zhǎng)舒一口氣。他清楚, 真正的生產(chǎn)流程, 終于能夠步入正軌了。
細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增慢，怎么才能提高效率
細(xì)胞狀態(tài)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定以后, 隨即迎面而來(lái)的便是擴(kuò)增階段了。該項(xiàng)目明確規(guī)定, 要于一個(gè)月時(shí)間內(nèi), 將細(xì)胞數(shù)量由幾百萬(wàn)加以擴(kuò)增, 直至成為幾十億, 就這樣的數(shù)據(jù)量級(jí)層面而言, 針對(duì)往常一貫存在的那種貼壁培養(yǎng)活動(dòng)來(lái)講, 其涉及到的困難系數(shù)著實(shí)不低呢。阿梁起初所選用的乃是傳統(tǒng)樣式的T175培養(yǎng)瓶, 單單憑借一個(gè)瓶所能培育的全部總數(shù), 最終也就不過(guò)勉強(qiáng)達(dá)到兩三千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞數(shù)額, 并且還極其需要頻繁地開(kāi)展換液以及傳代等操作, 如此一來(lái), 人工所需耗費(fèi)的成本便高高在上了, 操作的次數(shù)更是繁多重重, 于此同時(shí), 污染所面臨的風(fēng)險(xiǎn)也伴隨這種情況而跟著成倍地攀升上去了。
阿梁進(jìn)行了一番算賬, 要是依照這個(gè)節(jié)奏, 僅僅是換液以及傳代, 每一天都會(huì)耗費(fèi)他大半天的時(shí)間, 根本沒(méi)辦法滿足項(xiàng)目進(jìn)度, 并且培養(yǎng)瓶所占用的培養(yǎng)箱空間也是很大的, 實(shí)驗(yàn)室里總共就只有那么幾臺(tái)培養(yǎng)箱, 全部堆滿也湊不齊需要的細(xì)胞數(shù)量。
阿梁講那些曾經(jīng), 他那時(shí)節(jié)是實(shí)實(shí)在在著了急的, 整日整日都在思索怎樣去提升效率。之后他查閱了數(shù)目繁多的資料, 還同行業(yè)內(nèi)的人士進(jìn)行了一番交流, 發(fā)覺(jué)好多人早就摒棄了僅僅依靠貼壁來(lái)開(kāi)展培養(yǎng)的方式，他們?cè)缇筒捎昧宋⑤d體或者懸浮培養(yǎng)的工藝。然而他所擁有的這個(gè)細(xì)胞系對(duì)貼壁存在依賴, 徑直改為懸浮模式是不切實(shí)際的, 最終他下定決心去嘗試運(yùn)用多層細(xì)胞工廠。
阿梁講述的多層細(xì)胞工廠, 實(shí)際上是一種內(nèi)部具備諸多層板結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)容器, 這等同于將數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶并排疊加所致后果, 會(huì)大幅增添培養(yǎng)涵蓋面積。他向供貨商索要并獲取了一些樣品, 進(jìn)行了連續(xù)兩批的測(cè)試運(yùn)用, 其呈現(xiàn)效果超乎預(yù)先認(rèn)知范圍地優(yōu)異。細(xì)胞于多層板之上的貼壁狀況以及生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)均頗為勻稱適宜, 并且在進(jìn)行換液操作以及收獲環(huán)節(jié)時(shí), 整個(gè)程序變得簡(jiǎn)便容易許多。
就是這樣, 阿梁將原來(lái)所有的T175瓶統(tǒng)統(tǒng)替換成了多層細(xì)胞工廠, 培養(yǎng)的面積一下子增大了差不多十倍之多, 每一個(gè)批次能夠收獲到的細(xì)胞數(shù)量為此也實(shí)現(xiàn)了成倍遞增, 由于擴(kuò)增的效率有所提高, 項(xiàng)目的進(jìn)度最終追趕并獲得了大部分所延誤的時(shí)間。
細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵參數(shù)，新手最容易忽略什么
處于六月中旬之際, 阿梁所負(fù)責(zé)的項(xiàng)目步入最為關(guān)鍵的蛋白表達(dá)時(shí)期。細(xì)胞量已然積攢充足, 緊接著要開(kāi)展誘導(dǎo)表達(dá)工作。參照先前的經(jīng)驗(yàn)看來(lái), 這一環(huán)節(jié)最怕碰到的狀況，便是細(xì)胞代謝狀態(tài)呈現(xiàn)出不穩(wěn)定情形, 進(jìn)而致使表達(dá)量無(wú)法提升上去, 或者致使產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
阿梁汲取了先前的教訓(xùn), 此番格外謹(jǐn)小慎微, 他每日都要記錄培養(yǎng)液當(dāng)中的葡萄糖濃度, 還要記錄乳酸濃度, 以及pH值, 還有溶氧量, 并且特意購(gòu)置了一臺(tái)便攜式的生化分析儀, 每一次取樣都要測(cè)量一遍。組里新入職的技術(shù)員小劉認(rèn)為他太過(guò)吹毛求疵, 覺(jué)得大致差不多就可以了, 沒(méi)有必要每日進(jìn)行測(cè)量。阿梁沒(méi)有跟他過(guò)多闡釋, 僅僅說(shuō)了一句: “細(xì)胞培養(yǎng)這件事情, 差一點(diǎn)點(diǎn), 結(jié)果就會(huì)相差很遠(yuǎn)。你要是不緊盯這些參數(shù), 它就會(huì)出狀況給你看?！?。
的確, 到了誘導(dǎo)之后的第三天, 阿梁發(fā)覺(jué)一個(gè)培養(yǎng)單元當(dāng)中的乳酸濃度忽然間升高了許多, pH也下降到了7.0以下。他馬上斷定是細(xì)胞密度過(guò)高, 代謝廢物積攢速度太快, 致使微環(huán)境惡化。他果斷迅速地, 給那個(gè)單元更換了半量的新鮮培養(yǎng)基, 與此同時(shí)降低了培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度, 將pH穩(wěn)定住。
在第二天的早上之際, 小劉于看到顯示出數(shù)據(jù)已然恢復(fù)得正常狀態(tài)的報(bào)告以后, 朝著阿梁豎起了大拇指。阿梁說(shuō)道, 存在著許多事物并非是在書本之上能夠被教會(huì)的, 你是必須要自己親身經(jīng)歷過(guò)吃虧的情況、踩過(guò)坑的狀況才可以真正記住的。
細(xì)胞培養(yǎng)出問(wèn)題，如何快速找到解決方案
終于, 耗時(shí)許久的項(xiàng)目, 于七月中旬, 順利地完成了。蛋白的表達(dá)量, 較預(yù)期而言, 竟然高出了15%, 并且, 所有的檢測(cè)結(jié)果, 均為合格。至此, 阿梁緊繃著的神經(jīng), 終于放松了下來(lái)。在周會(huì)上, 公司領(lǐng)導(dǎo)特意點(diǎn)名, 對(duì)他進(jìn)行了表?yè)P(yáng)。然而, 只有阿梁自己心里明白, 一路走來(lái), 每一道難關(guān), 都是在不斷嘗試犯錯(cuò), 進(jìn)行總結(jié), 向他人請(qǐng)教, 持續(xù)學(xué)習(xí)之后, 才得以跨越過(guò)去的。
上一個(gè)月, 我倆再次談及了這件事情, 阿梁講, 他隨后將整個(gè)進(jìn)程里碰到的全部問(wèn)題、緣由辨析、處理辦法都?xì)w納成了一份詳盡的操作指南, 發(fā)送給了小組里的每一個(gè)人。他還把那個(gè)文檔分享到了幾個(gè)行業(yè)內(nèi)交流群組, 結(jié)果好多人私下給他發(fā)消息說(shuō)“非常實(shí)用”。阿梁跟我講, 實(shí)際上細(xì)胞培養(yǎng)這個(gè)范疇, 很多疑問(wèn)前人早就碰到過(guò), 只是大家平常各自忙各自的事情, 信息傳播不夠充分。要是有人能夠把經(jīng)驗(yàn)有條理地梳理出來(lái), 對(duì)于新人而言能夠少走許多冤枉路。
我向他詢問(wèn), 要是針對(duì)剛進(jìn)入行業(yè)的人給出一句話的建議的話, 你會(huì)講些什么。阿梁思考了一番, 說(shuō)道: “不要懼怕出現(xiàn)問(wèn)題, 然而要學(xué)會(huì)從問(wèn)題當(dāng)中挖掘出東西來(lái)。每一回的污染, 每一次細(xì)胞狀態(tài)的波動(dòng), 都是你提升工藝水平的契機(jī)。不要僅僅只關(guān)注淺層的現(xiàn)象, 要朝著深入去思考, 朝著上游探尋原因。細(xì)胞培養(yǎng)并非是玄學(xué), 它屬于科學(xué), 每個(gè)變量都是有蹤跡可以追尋的。”。
電話掛斷之后, 我于電腦跟前坐下, 將阿梁所講之事再次梳理了一回。說(shuō)實(shí)話, 從事生物實(shí)驗(yàn)工作之人, 哪有沒(méi)遭受過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)之困擾的呢。然而正如阿梁所講, 只要你樂(lè)意靜下心, 把控好進(jìn)程狀況, 緊盯住細(xì)節(jié)之處, 那些曾經(jīng)帶給你困擾的難題, 終有一日會(huì)變?yōu)槟憬?jīng)驗(yàn)寶庫(kù)中最為珍貴的一部分。
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