上周五夜里十一點, 我接到老周打來的電話, 電話那頭他的聲音有些疲憊, 卻又帶著一絲興奮, 他說: “兄弟, 終于弄好了, 若不是你先前跟我講的那一批PCR試劑盒, 我這個項目真的會失敗?！?。
我認識快十年的朋友是老周, 他在一家第三方醫(yī)學檢驗所擔任技術主管, 說是主管, 可事實上是個啥都必須管的角色, 從設備維護開始, 到試劑采購, 再到實驗流程優(yōu)化, 事事都要操心, 他所在的檢驗所規(guī)模不大, 然而接的單子卻不少, 主要是給周邊幾個縣市的疾控中心以及衛(wèi)生院做傳染病檢測。
今年三月份的時候, 他們忽然接到了這樣一個大工作, 一個區(qū)級的疾控中心要求他們?nèi)コ袚慌鷳睓z測的任務, 時間非常緊迫, 樣本數(shù)量特別大, 還要求在七天之內(nèi)給出結果。老周那時滿懷興致地接下了, 認為這是所里擴展業(yè)務的一個很好的機會?？墒菦]過兩天, 他就發(fā)覺事情并非那么容易。
為什么PCR試劑盒的靈敏度這么重要
老周以往用來進行PCR檢測的試劑盒始終來源于一家有著較長經(jīng)營時間的供應商處, 產(chǎn)品價格并沒有具備較低的優(yōu)勢, 然而存在顯著特性即具備穩(wěn)定性?？墒沁@次所布置的任務對于需要檢測的病原體來說有著特殊的類型, 那家供應商所供應產(chǎn)品無法全面含括所有范圍, 并且具備很低的靈敏程度不足以有效檢測。老周開展了一次預先性的檢測實驗, 結果發(fā)現(xiàn)對于濃度較低的樣本能夠檢測出來的概率僅僅只有百分之七十多罷了, 這就表明存在數(shù)量不少的呈現(xiàn)陽性的樣本很有可能會被遺漏掉。
當時他著急了, 給我打電話講, 兄弟, 有一個陽性被漏檢了, 如此情形后續(xù)會傳染出去多少人, 這般責任我實在擔當不起。而后我說道, 那樣的話你唯有更換試劑盒才行。他神情無奈地嘆了一口氣, 表明換掉是不難, 可換完以后整個流程都得再次去進行驗證, 然而當下時間是不夠用的。我又講, 你要是再這么拖延下去, 時間就會愈發(fā)不夠用。
他咬了咬自己的牙, 接著啟動四處打聽的行動, 去探尋看哪一家的PCR試劑盒靈敏度程度高, 并且覆蓋范圍全。他翻閱了幾個涉及檢測行業(yè)領域的論壇, 向為數(shù)不多的幾個同行朋友進行問詢, 又查看了幾家不同品牌所產(chǎn)出被稱作技術白皮書的東西, 最終確定鎖定了兩個可供選擇備用的目標。
怎么判斷PCR試劑盒的批間差是否穩(wěn)定
做事極為謹慎的老周, 不會單單只看參數(shù), 他向兩家不同的公司索要了試用品, 親自動手去做批間差測試, 那批間差是什么呢, 它指的是, 不同批次生產(chǎn)出來的試劑盒, 針對同一個樣本進行檢測時, 其結果能否維持一致。
他開展了為期三天的實驗, 每日所采用的是同一批樣本, 分批運用不同批次的試劑盒去運行一輪。其最終所示結果為, 對于一個品牌的試劑盒而言, 在連續(xù)三天的時間里, Ct值呈現(xiàn)出極為顯著的波動狀態(tài), 最大差值多達1.8個循環(huán)；然而, 另一個品牌的試劑盒, 其波動幅度成功控制在了0.5個循環(huán)以內(nèi)。老周據(jù)此選擇了后者。
后邊他同我講, “進行檢測時最擔憂的便是, 今日呈現(xiàn)陽性，明日卻變?yōu)殛幮? 在樣本尚無變換的情況下, 試劑率先發(fā)生變化了。批間差異顯著的試劑盒, 是根本不敢加以使用的”。
于此我欲言, 設若乃從事檢測者, 此批間差之指標勢必要于采購之前予以驗證?？v然參數(shù)看似漂亮那亦是無用之物, 惟實操是否穩(wěn)妥方為關鍵所在。此次老周之選擇無誤, 于其后之大批量檢測進程里, 針對同一樣本于不同時刻以及不同批次情形下, Ct 值幾近未出現(xiàn)漂移現(xiàn)象, 結果之一致性極為良好。
采購PCR試劑盒時要注意哪些參數(shù)
老周在確定品牌之后, 便著手開始仔細查看參數(shù), 他向我列舉了幾個關鍵要點, 分別是靶基因覆蓋范圍, 檢測下限, 擴增效率以及交叉反應率, 他表示靶基因覆蓋范圍格外重要, 原因在于此次檢測的病原體變異速度較快, 倘若試劑盒僅僅覆蓋了保守區(qū), 一旦出現(xiàn)變異情況, 就極有可能導致漏檢。
他測過檢測下限, 那家試劑盒能夠穩(wěn)定地去檢出每微升含有十個拷貝的樣本。他算過擴增效率, 斜率接近于負三點三, R2值在零點九九以上, 這表明線性關系是很好的。他也做了交叉反應率, 使用了十幾個近緣病原體的核酸樣本, 全部呈現(xiàn)為陰性, 不存在假陽性的出現(xiàn), 這便是全部情況了。
他特地向供應商詢問了一個細節(jié), 即試劑盒里是否有內(nèi)置內(nèi)參。供應商表示有, 并且內(nèi)參基因的擴增曲線與靶基因的擴增曲線互不干擾。老周稱這一點極為重要, 因為內(nèi)參能夠監(jiān)控核酸提取以及擴增過程是否存在問題, 要是沒有內(nèi)參, 當結果出現(xiàn)異常時, 根本無法知曉是樣本的問題還是試劑的問題。
PCR試劑盒儲存和運輸條件有多嚴格
老周當時碰到了一個麻煩的狀況, 時間如此緊張, 試劑盒能否按時抵達，并且儲存條件能否得以確保。
他往昔曾吃過虧, 有一回于夏天所進的試劑盒, 在運輸途中冷鏈斷了一回, 到貨之際里面的冰袋皆已融化, 他那時未做仔細檢查便使用了下去, 結果致使一批樣本全然出現(xiàn)問題, 隨后重新購置了試劑盒才得以補測回來, 耽擱了三天時間。
這次, 他留了個心眼, 特意跟供應商確認了運輸方案, 那就是全程冷鏈運輸, 溫度記錄儀要隨箱放置, 到貨之后要先查驗溫度曲線然后才能簽收。到貨當日, 他親自盯著, 打開箱子一看, 溫度記錄顯示全程的溫度處于二到八攝氏度之間, 且冰袋還是硬的, 這時他才放心地將其入庫。
于儲存范疇, 他依據(jù)說明書將試劑盒予以分類存放, 對于酶類試劑放置于零下20攝氏度之處，而其他部分則放置于2到8攝氏度的地方。他還特地于冰箱門上粘貼了一張標簽, 其上書寫有過期日期以及開瓶日期, 以此便利后續(xù)進行追溯。
怎樣提升PCR試劑盒的使用效率
量那么大的任務, 僅試劑盒狀況尚可還不行, 老周還在思索怎樣去提升效率, 他將實驗流程進行了優(yōu)化, 把樣本核酸提取以及PCR體系配制的時間錯開, 由兩個人交替去操作, 達成流水線作業(yè)效果。
原先是, 他們一天當中, 最多能做三百個樣本, 經(jīng)過優(yōu)化以后, 一天能夠做到五百個。他講, 這事項同試劑盒是存在關聯(lián)關系的, 那家試劑盒的預混液是即可以使用的類型, 不需要自己單獨去配制各種各樣的組分, 僅僅直接添加模板以及水就可以達成, 節(jié)省下來了相當多的時間。并且, 擴增程序同樣是較快的存在, 標準程序僅僅需要八十分鐘, 相較于市面上眾多的產(chǎn)品, 快出來了二十分鐘。
老周還講了一點, 試劑盒說明書的詳細程度是很關鍵的。他曾使用過一款試劑盒, 其說明書存在諸多錯別字, 操作步驟表述模糊, 他致電詢問技術支撐, 對方也未能清晰解答?，F(xiàn)在這款試劑盒的說明書步驟明晰, 并且附帶了常見問題排查指南, 即便新手依照其操作也不會出現(xiàn)差錯。
到第五天之際, 老周他們完成了百分之九十的檢測任務, 所有陽性樣本皆被準確檢出沒出現(xiàn)陰性樣本誤報情況如此種種得到了疾控中心負責人打來電話表示認可, 老周長長地舒了一口氣。
他在那之后請我吃飯, 然后端起了杯子, 對著我說: “倘若這次不是更換了那一批PCR試劑盒, 我估摸就要出狀況了。哪怕參數(shù)再好, 要是不親自去驗證一下, 心里終究是不踏實的。并且, 揀選對了試劑盒, 整個流程都順暢起來了, 就連帶著團隊也輕松了許多。”。
我向他詢問往后是否還會更換供應商, 他講短期內(nèi)不會, 緣由是已經(jīng)驗證過了, 要是更換新的那就又得重復折騰一回。不過他也闡明會定時留意市場上的新品, 倘若有更優(yōu)質(zhì)的, 能夠開展對比測試, 以此保證技術不落后于他人。
這便是老周的經(jīng)歷, 要是你正因PCR試劑盒之選犯愁, 那就不妨如他那般，從靈敏度、批間差、參數(shù)之細節(jié)、儲存運輸、使用效率這些層面予以考察, 別光瞅價格, 也別僅看品牌, 親身做上幾輪驗證, 勝過看一百份宣傳資料, 畢竟, 檢測這事, 結果有誤便為零, 不存在中間數(shù)值。
