上周三, 晚上十一點(diǎn)的時(shí)候, 老張給我發(fā)來了一條微信語音, 那聲音之中帶著難以掩飾的興奮, 說道: “終于搞定了！連續(xù)折騰三個(gè)月, 這次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一口氣全跑通了。”老張是我認(rèn)識五年的朋友, 他在一家第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所述職擔(dān)任技術(shù)主管職位。該醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室每天要對上千份樣本施行處理操作, PCR擴(kuò)增試劑盒的穩(wěn)定性以及靈敏度，直接決定他能否按時(shí)提交報(bào)告。
PCR擴(kuò)增試劑盒怎么選才靠譜？
以做傳染病病原體檢測為主的老張他們的實(shí)驗(yàn)室, 樣本類型繁雜多樣, 包括咽拭子, 還有痰液, 甚至組織勻漿都涵蓋其中。去年年末, 鑒于業(yè)務(wù)量急劇增長，其實(shí)驗(yàn)室購進(jìn)了一批新品牌的PCR擴(kuò)增試劑盒, 老張起初認(rèn)為性價(jià)比還算可以, 畢竟相較于之前所使用的, 價(jià)格便宜近乎三成。
結(jié)果沒用兩周, 問題就冒出來了, 有批樣本出現(xiàn)了明顯非特異性信號的擴(kuò)增曲線, 有些弱陽性樣本直接被漏檢了, 那段時(shí)間老張?zhí)焯旒影鄰?fù)核數(shù)據(jù), 客戶催報(bào)告的電話一個(gè)接一個(gè), 他跟我吐槽說, 試劑盒要是關(guān)鍵時(shí)刻出問題, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的周期都得往后拖。
擴(kuò)增效率低是什么原因?qū)е碌模?/h2>
先是老張針對問題進(jìn)行了全面排查, 涵蓋核酸提取環(huán)節(jié), 也包括儀器校準(zhǔn)方面, 就連操作人員的加樣手法都予以了檢查, 之后才察覺到原來是PCR擴(kuò)增試劑盒里的酶體系出現(xiàn)了問題。隨后他與廠家技術(shù)支撐取得聯(lián)系, 對方給出的解釋是批間差異控制不夠嚴(yán)謹(jǐn), 致使部分批次的擴(kuò)增效率有所降低。
老張說道, 你去思索一下, 我每日要進(jìn)行兩百多個(gè)反應(yīng), 只要有一個(gè)孔出現(xiàn)問題, 那么, 就極有可能對整個(gè)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生牽連。他規(guī)定實(shí)驗(yàn)室每個(gè)月都要開展一次試劑盒的批間穩(wěn)定性驗(yàn)證, 運(yùn)用已知其濃度的標(biāo)準(zhǔn)品去跑三重復(fù), 從而查看Ct值的變異系數(shù)。以往所使用的那款試劑盒, 其CV值始終是被控制在1.5%以內(nèi)的, 然而, 在更換了新的牌子之后, 有些批次直接飆升到3%以上。
PCR擴(kuò)增試劑盒靈敏度不夠怎么辦？
今年三月份的時(shí)候, 老張接到了一個(gè)緊急的項(xiàng)目, 這個(gè)項(xiàng)目是要對一批低病毒載量的樣本進(jìn)行檢測。他把庫存里剩余的幾盒 PCR 擴(kuò)增試劑盒翻了出來, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度根本無法達(dá)到檢測限的要求。試劑盒的最低檢測限僅僅只能達(dá)到每一毫升500拷貝, 然而項(xiàng)目所要求的卻是每一毫升200拷貝。
老張當(dāng)時(shí)所采取的做法是, 與之前合作過的三個(gè)品牌代理商取得聯(lián)系, 拿來他們的試劑盒進(jìn)行平行比對。他運(yùn)用了同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋, 從每毫升一千萬拷貝開始一直稀釋到每毫升五十拷貝, 針對每個(gè)濃度都重復(fù)八次操作。三天之后結(jié)果得以呈現(xiàn), 僅有其中一個(gè)品牌的試劑盒在每毫升一百拷貝的濃度狀況下依舊能夠穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)檢出, 其擴(kuò)增曲線起峰表現(xiàn)正常, 不存在非特異條帶。
當(dāng)時(shí), 我跟老板講, 不能僅看價(jià)格, 實(shí)驗(yàn)室的信譽(yù)相較于省錢可要重要得多。老張隨后把那批低靈敏度試劑盒全都退回去了, 還換上了經(jīng)過驗(yàn)證的產(chǎn)品。
PCR擴(kuò)增試劑盒對不同樣本類型的適用性如何？
老張實(shí)驗(yàn)室所承接的樣本類型繁雜異常, 存在著從口腔黏膜刮取下來的樣本, 有痰液樣本, 另外還存在從外院送來的經(jīng)石蠟包埋組織所提取的核酸樣本。不同樣本當(dāng)中殘留的抑制劑種類以及濃度存在諸多不同, 有一些試劑盒對于復(fù)雜樣本的耐受性極為糟糕, 一旦進(jìn)行操作就會(huì)呈現(xiàn)出問題。
有這么回事, 他曾跟我說起一個(gè)事兒, 是關(guān)于案例的, 有一批痰液樣本, 使用了一款號稱具備“通用型”的 PCR 擴(kuò)增試劑盒, 結(jié)果, 一半數(shù)量還要多的樣本, 其中的內(nèi)標(biāo)都沒能擴(kuò)增出來。后來, 他去查閱文獻(xiàn)才弄明白, 痰液當(dāng)中的粘蛋白以及多糖成分會(huì)對聚合酶的活性起到抑制作用, 所以必須要搭配專門的去抑制劑方案才可以。
“自那之后, 我規(guī)定實(shí)驗(yàn)室每當(dāng)有一款新的試劑盒進(jìn)入, 都要先選用五種不一樣的樣本類型去做驗(yàn)證, 痰液選取十份、血液選取十份、拭子選取十份、組織選取十份、糞便選取十份?！崩蠌堉v。此流程盡管耗費(fèi)時(shí)間, 可是能夠防止大規(guī)模實(shí)驗(yàn)失敗。
PCR擴(kuò)增試劑盒的保存和運(yùn)輸需要注意什么？
今年夏天, 老張所在的實(shí)驗(yàn)室出了意外，一批從供應(yīng)商倉庫發(fā)出的PCR擴(kuò)增試劑盒原本要通過物流冷鏈運(yùn)輸, 可冷鏈斷掉了, 在常溫狀態(tài)下放置了兩天才抵達(dá), 老張那時(shí)沒留意, 直接把試劑盒收進(jìn)了冰柜, 后來使用時(shí)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效率普遍偏低, 懷疑是酶活性部分已喪失。
過后, 他安排實(shí)驗(yàn)室特意開展了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn), 此實(shí)驗(yàn)將同一批號的試劑盒區(qū)分成三組, 其中一組在整個(gè)過程中保持冷鏈狀態(tài), 一組在常溫環(huán)境下放置二十四小時(shí), 一組在常溫環(huán)境下放置四十八小時(shí), 隨后運(yùn)用同樣的模板去進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增, 最終發(fā)覺, 在常溫下放置二十四小時(shí)的試劑盒, 其Ct值平均延后了一點(diǎn)二個(gè)循環(huán), 放置四十八小時(shí)的則延后了二點(diǎn)八個(gè)循環(huán), 并且其重復(fù)性也出現(xiàn)了變差的情況。
以下事情發(fā)生之后, 我吩咐采購部門在那份合同當(dāng)中添加了一項(xiàng)條款, 規(guī)定要求供應(yīng)商給出完整無缺的冷鏈運(yùn)輸記錄, 到達(dá)貨品之后需要在當(dāng)場進(jìn)行溫度測量, 要是溫度超出適宜范圍就要直接拒絕接收。”老張如此講道。
PCR擴(kuò)增試劑盒的批間穩(wěn)定性怎么保證？
在老張的實(shí)驗(yàn)室里, 現(xiàn)在存在著一個(gè)固定的流程, 那就是: 每當(dāng)有新批號的PCR擴(kuò)增試劑盒到貨后, 都要單獨(dú)進(jìn)行留樣以便做性能確認(rèn), 他具體會(huì)用自行配制的標(biāo)準(zhǔn)品去跑梯度稀釋, 從而確認(rèn)擴(kuò)增效率處于90%到110%這個(gè)范圍之間, 而且還要確保和上一批的Ct值差異量不超過0.5。
“批間穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)便是擴(kuò)增效率的一致性之舉以及 Ct 值的重復(fù)性之行。”老張歸納講道。他往昔碰到過一批試劑盒, 針對同一個(gè)樣本, 上午進(jìn)行檢測運(yùn)行, 下午再次開展運(yùn)行, Ct 值相差了 0.8, 歷經(jīng)半天時(shí)間的調(diào)查核對, 方才知曉是試劑盒批次存在差異所引發(fā)的情況。
每個(gè)月, 老張都會(huì)進(jìn)行一回內(nèi)部質(zhì)控, 將當(dāng)月各個(gè)批次的試劑盒性能數(shù)據(jù)匯總為表格, 發(fā)送給實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人以及采購部門。他對我說: “如此這般去做, 盡管工作量有所增加, 然而相較于出了問題之后再去返工, 顯然要?jiǎng)澦阍S多。”。
PCR擴(kuò)增試劑盒的性價(jià)比如何綜合評估？
后來, 老張進(jìn)行了一番算賬。先前, 他貪圖便宜購買了那一批次的試劑盒, 其單價(jià)確實(shí)是降低了, 然而, 由于靈敏度不足, 進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)漏檢的情況, 并且復(fù)檢率提高了將近15%, 再加之人工成本以及報(bào)告延遲所要面臨的罰款, 最終核算下來, 相比使用好的試劑盒, 反而更加昂貴了。
“我此刻評估著PCR擴(kuò)增試劑盒呢, 并非觀測單價(jià), 而是考量單次有效檢測成本。”老張如此闡釋道。他將試劑盒價(jià)格攤?cè)肫渲? 又把復(fù)檢率納入計(jì)算范疇, 還把無效數(shù)據(jù)比例一并考慮進(jìn)去, 同時(shí)計(jì)入人工耗材費(fèi)用, 如此這般, 才核算出一個(gè)真切的成本。
今年四月, 老張的實(shí)驗(yàn)室重新挑了供應(yīng)商。他們花一個(gè)多月, 從四家候選品牌里篩, 最后選了家技術(shù)指標(biāo)最穩(wěn)、技術(shù)支撐響應(yīng)最快的。單價(jià)比之前貴了一成, 可整體檢測效率提高了, 客戶投訴率降至零。
前些日子老張邀我用餐, 手持杯子講道: “從事檢測工作, 試劑盒如同戰(zhàn)士手中之槍。若槍不準(zhǔn)確, 即便槍法高超亦是枉然。當(dāng)下實(shí)驗(yàn)室所使用的這款PCR擴(kuò)增試劑盒, 運(yùn)行長達(dá)大半年以來從未出現(xiàn)過一回批量性質(zhì)的問題, 這讓我內(nèi)心安穩(wěn)許多了。”。
