一個(gè)實(shí)驗(yàn)員朋友的親身經(jīng)歷
上個(gè)月, 我那位在中科院某研究所工作的朋友老張得以解決困擾他半年的ELISA檢測試劑盒選擇問題, 他在電話里跟我感慨, 早知道如此這般選擇, 他至少能省下三個(gè)月時(shí)間以及兩萬塊錢。
今年, 老張是三十四歲, 于中科院開展免疫學(xué)相關(guān)研究已然歷經(jīng)六年時(shí)長, 他平日里主要做各類蛋白定量檢測, ELISA檢測試劑盒差不多是他每日都要去碰觸交流使用的工具, 正常情形而言, 做了這般多年的實(shí)驗(yàn), 理應(yīng)駕輕就熟毫無問題的呀, 可去年年末的時(shí)候他卻摔了個(gè)極為嚴(yán)重的跤。
去年十一月, 他們實(shí)驗(yàn)室承接了一個(gè)重要合作項(xiàng)目, 該項(xiàng)目要在兩個(gè)月內(nèi)做完三百份血清樣本的細(xì)胞因子檢測。老張負(fù)責(zé)整個(gè)檢測流程的方案設(shè)計(jì)以及執(zhí)行。那時(shí)老張想都沒多想, 直接采用了之前合作過的一個(gè)品牌的ELISA檢測試劑盒, 他心里覺得都是做同樣的指標(biāo), 理應(yīng)不會(huì)出現(xiàn)什么問題。
第一批五十份樣本檢測完畢之后, 老張瞅著數(shù)據(jù)愣住了。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R平方值僅僅是0.89, 大大低于0.98的可接受標(biāo)準(zhǔn)。更讓人覺得頭疼的是, 復(fù)孔間的變異系數(shù)高達(dá)百分之十五, 有些樣本的OD值居然出現(xiàn)了負(fù)值。這表明這批ELISA檢測試劑盒的質(zhì)量根本不符合要求, 所有數(shù)據(jù)都無法使用。
老張急忙聯(lián)系了那個(gè)品牌的代理商, 對(duì)方先是推三阻四, 而后才承認(rèn)這批試劑盒在生產(chǎn)之中或許存在批次差異, “批次差異”這四個(gè)字吶, 從實(shí)驗(yàn)人員耳朵聽來絕對(duì)是噩夢(mèng)。老張耗費(fèi)了整整一周的時(shí)間重新檢測了那五十份樣本, 然而時(shí)間已經(jīng)被耽誤了不少。
那個(gè)周末, 老張請(qǐng)我去喝酒, 他滿臉愁容地講: “你曉得最可怕的情形是啥不? 我先前一直認(rèn)定只要是在市面上能夠買到的ELISA檢測試劑盒, 其 Quality 都大致相當(dāng)。如今來看, 這個(gè)想法實(shí)在是太過天真?！?。
ELISA檢測試劑盒的核心參數(shù)怎么看
技術(shù)參數(shù), 老張開始著手認(rèn)真研究ELISA檢測試劑盒的。他有一番發(fā)現(xiàn), 那就是在好多人面臨選擇之際, 僅僅眼光聚焦于價(jià)格以及品牌之上, 然而卻把幾個(gè)確實(shí)至關(guān)重要的核心關(guān)鍵點(diǎn)給疏忽遺漏了。
第一位的是靈敏度。老張要檢測的細(xì)胞因子 ，在血清里 , 濃度極低 , 有的甚至僅幾個(gè)皮克每毫升而已。要是所選的ELISA檢測試劑盒 , 靈敏度欠缺 , 那低濃度樣本 , 根本檢測不出。他翻看先前那個(gè)品牌的說明書 , 發(fā)覺最低檢測限是十五皮克每毫升 , 而他們所需的精度 , 至少得達(dá)到五皮克每毫升。
并非不重要的是特異性。血清樣本之中存有數(shù)量眾多的成千上萬種蛋白質(zhì), 要是ELISA檢測試劑盒的抗體交叉反應(yīng)率處于較高的狀況, 便會(huì)將屬于其他蛋白的信號(hào)錯(cuò)誤地判斷成為目標(biāo)蛋白。老張講道: “這恰似于人群里頭尋覓一個(gè)人, 最終卻把那些長得相像的人全都認(rèn)錯(cuò)了?！?。
存在檢測范圍, 不同的ELISA檢測試劑盒, 其線性檢測范圍有的只覆蓋幾個(gè)數(shù)量級(jí), 有的則高達(dá)能覆蓋五個(gè)數(shù)量級(jí)以上, 兩者差異極為顯著。老張所擁有的樣本, 濃度跨度極大, 從幾皮克一直到幾百納克都存在。倘若檢測范圍過于狹窄, 那么對(duì)于高濃度樣本而言, 就必須進(jìn)行稀釋操作, 然而稀釋又必定會(huì)引入新的誤差。
如何驗(yàn)證ELISA檢測試劑盒的穩(wěn)定性
老張?jiān)谠庥隽瞬瓤忧闆r之后, 就開始了對(duì)ELISA檢測試劑盒穩(wěn)定性問題格外予以重視, 他跟我所言, 穩(wěn)定性這般事物, 僅僅瞻看說明書可無法瞧出來的, 勢(shì)必要自身施以做驗(yàn)證的操作。
之后他更換了另一品牌的 ELISA 檢測試劑盒, 此次變得機(jī)靈了些。拿到試劑盒后, 他未直接處理樣本, 而是先行開展三件事情。首件事為進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn), 于已知濃度的樣本內(nèi)添加不同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品, 以此查看回收率能否處于百分之九十至百分之一百一之間。第二件事為開展精密度驗(yàn)證, 接連制作五塊板子, 看批內(nèi)以及批間的變異系數(shù)能否控制在百分之十以內(nèi)。第三件事是進(jìn)行凍融穩(wěn)定性測試, 將試劑盒多次凍結(jié)融化三次, 看效價(jià)有無降低。
這三步驗(yàn)證全都做完畢之后, 老張的心里便有了底氣, 這底氣源自他所挑選的那個(gè)ELISA檢測試劑盒, 該試劑盒的加標(biāo)回收率處于百分之九十五至百分之一百零三這個(gè)范圍里, 它的批內(nèi)變異系數(shù)僅僅只有百分之四點(diǎn)五, 它的批間變異系數(shù)為百分之六點(diǎn)八, 在經(jīng)過三次凍融之后其效價(jià)幾乎不存在任何變化, 老張說道: “這樣的一個(gè)結(jié)果讓我睡了個(gè)安穩(wěn)覺?！?。
不同樣本類型對(duì)ELISA檢測試劑盒的影響
主要以血清作為樣本的是老張, 然而在他實(shí)驗(yàn)室隔壁工作的同事所做的卻是細(xì)胞培養(yǎng)上清, 看似僅僅是樣本類型存在差異, 可對(duì)于 ELISA 檢測試劑盒的要求差距卻是極大。
有著復(fù)雜成分的血清樣本, 其中含有大量蛋白質(zhì)、脂類以及各種代謝物, 極易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)指的是，樣本里的非目標(biāo)成分對(duì)抗原抗體反應(yīng)造成干擾, 致使檢測結(jié)果出現(xiàn)偏高或者偏低的情況。老張之前那個(gè)品牌存在問題, 部分緣由就是基質(zhì)效應(yīng)未妥善處理好。
細(xì)胞培養(yǎng)的上清相對(duì)較為潔凈, 然而問題在于, 某些細(xì)胞因子于培養(yǎng)環(huán)境里極易發(fā)生降解。老張的同事曾遭遇過此般狀況, 其所使用的ELISA檢測試劑盒雖說靈敏度頗高, 可是由于樣本保存方式不妥當(dāng), 檢測出來的結(jié)果相較于實(shí)際數(shù)值低了許多。后來他們察覺到, 必須要在樣本當(dāng)中添加蛋白酶抑制劑, 而且要在兩小時(shí)之內(nèi)完成檢測。
有組織勻漿樣本方面, 這里面含有的干擾物質(zhì)更為繁多, 老張講道: “不同的樣本種類, 猶如各異的戰(zhàn)場。同樣一個(gè)ELISA檢測試劑盒, 于血清當(dāng)中表現(xiàn)較為良好, 而到了組織勻漿里面有可能全然不行。故而在挑選試劑盒時(shí), 務(wù)必要跟廠家確認(rèn)他們有沒有針對(duì)你的樣本類型開展過驗(yàn)證?！薄?/p>
批次一致性的重要性
說起來老張那個(gè)項(xiàng)目里頭最大的教訓(xùn), 便在于忽略了ELISA檢測試劑盒的批次一致性。他頭一回所使用的試劑盒, 在從第一批轉(zhuǎn)變到第二批的時(shí)候, 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率居然相差了差不多百分之二十。這究竟意味著什么, 那就是把基于第一批試劑盒所制作出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 生硬地套用于依賴第二批試劑盒能夠獲取的數(shù)據(jù)之上, 最終呈現(xiàn)出來的結(jié)果竟然是完全無法對(duì)上吻合的。
作為長期項(xiàng)目而言, 批次一致性顯得極為關(guān)鍵, 重要到不可或缺, 有些項(xiàng)目持續(xù)時(shí)長可達(dá)半年, 甚至更長是一整年度, 從中間貫穿的過程來看, 可能會(huì)存在多次采購ELISA檢測試劑盒的必要需求和情況, 要是不同批次之間所呈現(xiàn)出來的差異情形過大, 那么整個(gè)項(xiàng)目所涉及的數(shù)據(jù), 均無法進(jìn)行合并在一起的分析操作。
老張后來所挑選的那個(gè)ELISA檢測試劑盒, 是由廠家給出詳盡批次驗(yàn)證報(bào)告的。在過去十二個(gè)月的時(shí)間里, 存在五個(gè)批次, 其標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距以及R平方值全都特別相近, 變異系數(shù)無不在百分之三以內(nèi)。老張聲稱: “有這份驗(yàn)證報(bào)告擺在這里, 我方至少可以安心依照同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線去核算后續(xù)的樣本?！?。
他專門和廠方的技術(shù)支持進(jìn)行了一次交流, 對(duì)方告知他, 批次一致性的關(guān)鍵之處在于抗體原料的穩(wěn)定性, 一些廠家為了削減成本, 會(huì)經(jīng)常更替抗體原料的供應(yīng)商, 如此一來生產(chǎn)出來的 ELISA 檢測試劑盒很難確保批次一致性, 而那些自行生產(chǎn)抗體的廠家, 批次一致性一般要好許多。
如何通過售后技術(shù)支撐降低試錯(cuò)成本
老張當(dāng)下每次挑選ELISA檢測試劑盒時(shí), 都會(huì)先同廠家的技術(shù)支撐交流半個(gè)小時(shí), 這么說道: 他聲稱一個(gè)優(yōu)秀的技術(shù)支撐, 能夠?yàn)槟闶∪テ鸫a一半的試錯(cuò)成本。
技術(shù)支撐究竟能給予怎樣的協(xié)助呢? 首先存在樣本測試這一環(huán)節(jié), 老張當(dāng)下會(huì)向廠家索要試用裝, 先行制作十幾份具備代表性的樣本, 查看數(shù)據(jù)是否契合預(yù)期, 部分廠家甚至甘愿為客戶免費(fèi)開展預(yù)實(shí)驗(yàn), 并出具完整的檢測報(bào)告。
接著是問題排查, 老張擁有一個(gè)微信群, 群里全是各個(gè) ELISA 檢測試劑盒廠家的技術(shù)支撐人員。當(dāng)遇到疑問時(shí), 于群內(nèi)發(fā)送一則消息, 有時(shí)候僅僅半小時(shí)便能尋得解決辦法。就像先前有一回他的板子背景值極為高, 技術(shù)支撐人員瞥一眼他所拍攝的照片, 立刻發(fā)覺問題源自洗板機(jī), 洗滌液殘留過于多。
再者是存在數(shù)據(jù)解讀, ELISA檢測試劑盒的數(shù)據(jù)處置有時(shí)頗為繁雜, 尤其是在開展競爭法ELISA之際, 標(biāo)準(zhǔn)曲線并非呈線性, 需運(yùn)用四參數(shù)邏輯回歸模型予以擬合, 優(yōu)質(zhì)的技術(shù)支撐會(huì)助力客戶確認(rèn)擬合參數(shù)是否恰當(dāng), 防止因數(shù)據(jù)處理失誤致使誤判。
老張講, 購買ELISA檢測試劑盒, 并非單純是對(duì)產(chǎn)品的購置, 更是對(duì)于服務(wù)的選購, 那些偏偏只售賣產(chǎn)品卻全然不管及售后的廠家, 哪怕價(jià)格極為便宜也千萬不要去選擇。
老張現(xiàn)在是怎么選ELISA檢測試劑盒的
在歷經(jīng)那次失敗所帶來的教訓(xùn)之后, 老張著實(shí)總結(jié)出了一套用于選擇ELISA檢測試劑盒的辦法。他講這套辦法現(xiàn)今于他們的實(shí)驗(yàn)室已然演變成了標(biāo)準(zhǔn)的流程。
先要明確要檢測哪些指標(biāo), 再得清楚對(duì)應(yīng)樣本類型是怎樣的, 接著要曉得預(yù)計(jì)的濃度范圍究竟是多少, 還需知道所需的靈敏度為多少, 第一步應(yīng)是確定需求, 這些信息越詳盡越好。
分兩步走, 第二步是要篩選候選產(chǎn)品, 老張會(huì)在數(shù)位主要的科研采購平臺(tái)那里進(jìn)行搜查行為, 把那排名處于靠前位置、評(píng)價(jià)狀況良好的產(chǎn)品逐項(xiàng)羅列出來, 接著他會(huì)著手去查閱這些產(chǎn)品所配有的說明書要點(diǎn)關(guān)注靈敏度、檢測涵蓋范圍、特異性、樣本驗(yàn)證情形等這類參數(shù)。
做預(yù)實(shí)驗(yàn)是第三步, 老張會(huì)向廠家申請(qǐng)?jiān)囉醚b，要是廠家不提供試用裝, 他會(huì)直接排除, 預(yù)實(shí)驗(yàn)需做加標(biāo)回收、精密度驗(yàn)證還有基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估, 至少得用三十份真實(shí)樣本。
第四步, 要施行對(duì)于廠家資質(zhì)開展考察的行動(dòng)。老張會(huì)去查看廠家所具備的生產(chǎn)資質(zhì)之情形, 查驗(yàn)認(rèn)證證書的相關(guān)狀況, 審視技術(shù)團(tuán)隊(duì)的背景情況。他尤為看重的是, 廠家是否擁有源自自身的抗體研發(fā)以及生產(chǎn)能力, 這是由于, 這意味著質(zhì)量控制方面能夠具備更有保障之類的狀況。
第五步是對(duì)售后支持予以確認(rèn), 老張會(huì)同廠家技術(shù)支撐團(tuán)隊(duì)構(gòu)建聯(lián)系, 確認(rèn)廠商于遭遇問題之時(shí)的響應(yīng)時(shí)長以及解決問題所采取的方式。
老張講道, 這套流程看上去繁雜, 然而做過一回之后, 后續(xù)便會(huì)輕松些。去年十二月時(shí), 他再度購置了一批ELISA檢測試劑盒, 嚴(yán)格依據(jù)這套流程操作下來, 截至目前已做了將近兩百份樣本, 數(shù)據(jù)相當(dāng)出色, R平方值均在0.995以上, 變異系數(shù)從未超出百分之八。
今年三月份之際, 老張所負(fù)責(zé)項(xiàng)目的全部檢測數(shù)據(jù)均已得出。合作方的負(fù)責(zé)人查看數(shù)據(jù)之后極為滿意, 當(dāng)場表明后續(xù)的合作能夠持續(xù)。老張跟我方說道: “你是否知曉, 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)便是如此這般, 跨出一步犯錯(cuò)之后每一步都會(huì)出錯(cuò)。ELISA檢測試劑盒盡管僅僅是一個(gè)小型工具, 然而它要是出現(xiàn)問題, 整條數(shù)據(jù)鏈都會(huì)崩塌。如今回想起來, 當(dāng)初那次失敗反倒成為一件有益之事, 起碼讓我學(xué)會(huì)了怎樣正確地挑選試劑盒。”。
現(xiàn)在老張?jiān)趯?shí)驗(yàn)室里搖身一變成為了ELISA檢測試劑盒方面的“專家”, 他構(gòu)建了一個(gè)共享文檔, 將自己使用過的每一個(gè)試劑盒的品牌、批次以及測試數(shù)據(jù)都予以記錄, 以此供其他同事進(jìn)行參考, 上個(gè)月, 隔壁實(shí)驗(yàn)室的一名博士生前來向他請(qǐng)教, 聲稱自己所使用的試劑盒數(shù)據(jù)始終處于不穩(wěn)定狀態(tài), 老張協(xié)助他展開了一番排查, 最后發(fā)覺問題源自樣本的凍融次數(shù)之上, 那個(gè)博士生先前為了節(jié)約樣本曾反復(fù)進(jìn)行了五次凍融操作, 結(jié)果致使諸多蛋白都出現(xiàn)了降解現(xiàn)象。
老張講, 進(jìn)行ELISA檢測時(shí), 試劑盒屬于工具, 選對(duì)該工具僅是第一步, 后續(xù)的操作細(xì)節(jié)顯得同樣關(guān)鍵, 然而話又說回來, 要是從一開始工具就沒選對(duì), 那此后操作再怎么精細(xì), 也是沒有作用的。
這大約便是老張 utilize 半年時(shí)長以及兩萬塊錢款所換來的教訓(xùn), 亦是其甘愿分享給全部從事 ELISA 檢測之人的經(jīng)驗(yàn)。
