我親眼見證朋友如何從“亂篩”到“穩(wěn)篩”
上月, 我前往深圳龍華, 去尋覓老朋友大劉, 與之一道用餐。大劉于一家生物公司任職研發(fā)主管, 其手下管理著十幾號(hào)工作人員, 每日皆與細(xì)胞以及分子進(jìn)行接觸交流。那日, 他甚是難得地未加班, 然而在用餐之際話語極為稀少, 眉頭緊皺的程度仿佛能夠夾死蒼蠅。
“怎么了？項(xiàng)目不順？”我問。
他輕輕地嘆了一口氣, 隨后將手中的筷子放置一旁, 接著說道: “高通量篩選已經(jīng)連續(xù)出現(xiàn)三次失敗的情況, 如今老板已然下達(dá)了最后通牒。要是再無法得出相關(guān)數(shù)據(jù), 那么整個(gè)季度的獎(jiǎng)金都將會(huì)化為泡影?！薄?/p>
在我聽他講完之后, 才察覺到他所踏入的那些坑, 實(shí)際上好多同行們也是都在踏足的。然而問題的根本源頭, 常常是出現(xiàn)在一個(gè)最為基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)里面——細(xì)胞株。
細(xì)胞株的狀態(tài)，真的有那么重要嗎？
大劉所在的公司, 所從事的是藥物靶點(diǎn)篩選服務(wù)工作, 其采用的乃是最為主流的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株體系。按照常理來講, 只要能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白穩(wěn)定地表達(dá)于細(xì)胞之中, 那么接下來進(jìn)行的篩選工作, 便屬于機(jī)械性的活兒。然而, 恰恰就是這種機(jī)械性的活兒, 卻最容易出現(xiàn)問題。
大劉向我抱怨, 表示: “有著相同的質(zhì)粒, 處在相同的轉(zhuǎn)染條件之下, 此次篩選出來的IC50跟上次相比, 差距差不多達(dá)到了三倍。我吩咐手下小弟去重復(fù)做了三遍, 然而其結(jié)果卻是一次比一次更偏離正常情況?！?。
我向他發(fā)問, 說道: “你能肯定, 每一次所使用的, 皆是同一批細(xì)胞株嗎? 其傳代的次數(shù), 是否相同? 冷凍保存以及復(fù)蘇的條件, 穩(wěn)定與否？”。
他當(dāng)時(shí)愣了一下, 隨后說道, 哪能去管得那么細(xì)致入微, 要是細(xì)胞數(shù)量多那就進(jìn)行擴(kuò)充, 要是數(shù)量不夠那就加以補(bǔ)充, 反正每一回都是從液氮當(dāng)中拿出來的。
這便是問題核心所在, 細(xì)胞株并非一次性使用的消耗品, 其具備生命特征是有生命的, 每一回進(jìn)行傳代都每一次傳代、每一次實(shí)施凍存, 均會(huì)致使基因表達(dá)水平產(chǎn)生漂移方面影響帶來基因表達(dá)水平的漂移, 你原本認(rèn)為是同一株細(xì)胞, 可實(shí)際上它或許已然出現(xiàn)變化“變心”了。
為什么篩選數(shù)據(jù)總是忽高忽低？
那天大劉回去以后, 特意耗費(fèi)了兩周時(shí)間, 重新審視了全部失敗的實(shí)驗(yàn)紀(jì)錄。他驚愕地察覺到: 所有數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常的實(shí)驗(yàn), 背后都指向同一個(gè)變量, 即細(xì)胞株的使用歷程。
比如說, 存在一批運(yùn)用處于傳代15次狀態(tài)的細(xì)胞所開展的實(shí)驗(yàn), 另外一批則采用了傳代25次的那種；從表面情形上去審視, 二者分明都是同一細(xì)胞株, 然而蛋白表達(dá)量的檢測(cè)最終結(jié)果卻相差了近乎20%；再有一回, 鑒于液氮罐出現(xiàn)故障, 臨時(shí)使用了另一批次被凍存的細(xì)胞, 結(jié)果得出那一批次在被凍存之前其狀態(tài)就已然是長滿了卻沒能夠及時(shí)進(jìn)行傳代。
大劉在微信上跟我說起這句話, 即“我一直認(rèn)定是操作手法出現(xiàn)異常狀況, 然而最終發(fā)現(xiàn)實(shí)際是細(xì)胞株批次里呈現(xiàn)的問題”, 其語氣之中明顯帶有懊惱之情。
實(shí)際上, 在相關(guān)領(lǐng)域之中存在著這樣一種說法, 那便是“細(xì)胞株倘若不一致, 那么所獲取的數(shù)據(jù)統(tǒng)統(tǒng)都等于白勞作”。眾多從事研發(fā)工作的人員耗費(fèi)大量的時(shí)間去對(duì)篩選條件予以優(yōu)化, 致力于構(gòu)建模型, 并且運(yùn)行算法, 然而卻忽視了處于最基礎(chǔ)層面的要點(diǎn)——你手中所掌握的細(xì)胞株是否真切可靠呢?
他花了三個(gè)月，終于摸到了門道
大劉這人存在那么個(gè)優(yōu)點(diǎn), 在認(rèn)栽以后會(huì)馬上著手想辦法, 他并未匆忙急忙地重新開展做實(shí)驗(yàn), 而是率先耗費(fèi)了三天的時(shí)間, 將所有能夠查到的有關(guān)細(xì)胞株管理的資料徹徹底底地翻了個(gè)遍。
他后來總結(jié)了三件事，我覺得很有參考價(jià)值。
其一, 構(gòu)建細(xì)胞株的“身份證”制度 , 每當(dāng)獲取新的細(xì)胞株 , 便要記載其來源 、凍存日期 、傳代次數(shù) 、培養(yǎng)基配方 , 切莫偷懶 , 即便僅僅多傳了一代 , 也要記錄下來 , 大劉特意弄了個(gè)Excel表格 , 要求實(shí)驗(yàn)室所有人員都務(wù)必填寫。
第二, 要嚴(yán)格控制傳代的次數(shù)。他為自己設(shè)定了一條紅線, 即對(duì)于同一個(gè)細(xì)胞株而言, 最多使用20代。一旦超過這個(gè)數(shù)量, 無論細(xì)胞生長得多么良好, 都要全部報(bào)廢, 然后重新從早期凍存的批次里進(jìn)行復(fù)蘇。這樣聽起來似乎有些浪費(fèi), 然而相比于整批數(shù)據(jù)作廢, 這點(diǎn)浪費(fèi)實(shí)在算不了什么。
其三, 于每次開展實(shí)驗(yàn)之前, 進(jìn)行“基準(zhǔn)測(cè)試”。在運(yùn)作高通量篩選以前, 先選取一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化合物來測(cè)定一下IC50, 要是結(jié)果偏離歷史均值超出15%, 那么這批細(xì)胞株便直接予以放棄。此一動(dòng)作僅僅需再多耗費(fèi)半天的時(shí)間, 然而卻能夠節(jié)省后續(xù)十天的返工時(shí)間。
一個(gè)簡單動(dòng)作，讓項(xiàng)目起死回生
大劉依照這套辦法再度走了一回流程, 他挑選了一個(gè)在前期的時(shí)候留存完好, 屬于早期代次的細(xì)胞株，于做完基準(zhǔn)測(cè)試之后, 方才著手展開正式的篩選工作。
結(jié)果怎么樣？
上周, 他給我打了個(gè)電話, 其語氣顯著地帶出輕松之感著: “這批數(shù)據(jù), 漂亮到了極點(diǎn), 進(jìn)行了接連三次的重復(fù)操作, IC50曲線, 幾乎呈現(xiàn)出全然重合的態(tài)勢(shì)。老板看過之后，直接給予了下一階段的經(jīng)費(fèi)批文。”。
我向他詢問其有怎樣的感想, 他這般說道: 在從前的時(shí)候, 一直認(rèn)為細(xì)胞株僅僅是一種工具罷了, 覺得人是否高級(jí)取決于技術(shù)如何。然而如今才弄清楚, 要是工具靠不住, 即便技術(shù)再好那也是徒勞無功的。進(jìn)行高通量篩選的時(shí)候, 最先要將細(xì)胞株管理妥善, 唯有如此這般才是最為節(jié)省錢財(cái)以及精力的方式。
看完他的故事，給做篩選的你三點(diǎn)建議
要是你正在施行與這相類似的實(shí)驗(yàn), 或者正打算開啟一個(gè)高通量篩選的項(xiàng)目, 我給出建議, 你預(yù)做三件事情。
首先, 花費(fèi)些許時(shí)間去整理你手中所擁有的細(xì)胞株庫存情況。 在這些庫存里, 哪些屬于較早些時(shí)候進(jìn)行凍存的? 哪些又是已經(jīng)歷經(jīng)了許多代別的傳代操作? 對(duì)于這些情況, 是否有著詳盡細(xì)致的記錄? 要是答案是相反情形的話, 那就趕快去補(bǔ)充完善它。
其二, 與團(tuán)隊(duì)確定一個(gè)細(xì)胞株運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)。傳代能夠達(dá)到的上限是多少? 凍存液采用何種配方? 復(fù)蘇過后到第幾天能夠開展實(shí)驗(yàn)? 將這些規(guī)則書寫下來，張貼在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的前方。
其三, 始終留存一個(gè)“黃金批次”, 在獲取到全新的細(xì)胞株后, 即刻進(jìn)行一批擴(kuò)增, 而后將其凍存于最為可靠的液氮罐之中, 此批細(xì)胞僅用于充當(dāng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參照標(biāo)準(zhǔn), 絕對(duì)不會(huì)輕易予以動(dòng)用。
高通量篩選屬于一個(gè)系統(tǒng)工程, 其變量眾多, 周期漫長, 成本高昂。有好多人將精力投入于算法優(yōu)化、數(shù)據(jù)分析以及化合物庫建設(shè)方面, 然而卻忽視了最為基礎(chǔ)、最易于被忽視掉的環(huán)節(jié), 此環(huán)節(jié)便是細(xì)胞株的穩(wěn)定性與一致性。
大劉用三個(gè)月的翻車經(jīng)歷換來的教訓(xùn)，希望你能提前看懂。
