這文章能解決什么問題？
當你處于正在開展兔原代細胞培養(yǎng)的狀況時, 要是發(fā)覺自己所分離出來的細胞始終生長欠佳, 又或者在培養(yǎng)過程中養(yǎng)著養(yǎng)著就死掉了, 那么這篇文章便是專門為你撰寫的。我身旁有一位朋友, 從事這一行業(yè)已經(jīng)三年多了, 幾乎踩遍了所有能夠踩到的坑, 最近終于探尋出了一套穩(wěn)定的方案。我將他的那段經(jīng)歷整理出來, 期望能夠幫你節(jié)省幾個月摸索的時日。
為什么兔原代細胞這么難養(yǎng)？
先講講我這位名為老周的朋友, 供職于一家生物技術(shù)公司搞研發(fā), 主要承擔(dān)動物原代細胞的分離以及培養(yǎng)方面的工作。去年年初之際, 公司承接了一個新項目, 此項目需要大量運用兔來源的原代細胞去構(gòu)建藥篩模型。那時老周覺得, 兔原代細胞呀, 和小鼠的原代細胞理應(yīng)相差無幾, 然而實際一做卻驚覺情況不對了。
曾經(jīng)有一回, 首次進行分離兔肝細胞的操作, 是依照小鼠的相應(yīng)流程去做的, 然而細胞得率低到了極其可憐的程度, 存活率還達不到百分之六十。那時, 老周正坐在超凈臺跟前, 對著顯微鏡觀察了許久, 內(nèi)心一下子涼了大半截。隨后, 他嘗試了十幾次, 對酶濃度、消化時間以及離心轉(zhuǎn)速都做了調(diào)整, 前前后后折騰了兩個月時間, 這才好不容易把得率提升到了能夠使用的水準。
難點在于兔原代細胞, 說白了存在兩點情況, 其一, 兔子的組織相較于小鼠更為致密, 其消化條件需要進行單獨的優(yōu)化, 其二, 兔細胞對于培養(yǎng)環(huán)境更為敏感, 稍有一點小變化它就會呈現(xiàn)出死亡的狀態(tài)給你看。
分離兔原代細胞，應(yīng)該注意哪些細節(jié)？
取材時間要卡準
老周跟我講, 他自打從動物房去取組織起就遭遇過狀況。頭一回取兔肝時, 從動物房拿到實驗室, 途中耗費了將近四十分鐘, 然而細胞分離出來后, 存活率徑直降至百分之四十。之后他察覺到, 兔組織離體以后氧化速度比小鼠快了許多, 必須在三十分鐘之內(nèi)著手處理。
老周當下所采用的方式為, 預(yù)先將全部試劑以及器械籌備妥當, 一旦動物房那邊發(fā)出通知, 他即刻拿著冰盒前往, 組織被取下后隨即就放入預(yù)先冷卻過的PBS之中, 而后一路小跑返回實驗室。他提及, 倘若這一步驟有所遲緩, 后續(xù)即便擁有再好的技術(shù)也無法挽回局面。
消化酶的濃度和時機怎么把控
是老周踩得最深的坑為此, 他起初采用和小鼠相同的膠原酶濃度展開操作, 然而經(jīng)歷兩小時的消化, 組織塊依舊呈現(xiàn)硬邦邦的狀態(tài)。他推測是否為濃度不足所致, 于是增添雙倍劑量的酶。最終細胞雖已出現(xiàn)情況, 卻全都遭受酶的損傷, 于顯微鏡下觀察可見, 碎片數(shù)量眾多。
隨后, 他翻閱查看了諸多大量的文獻資料, 向一位從事兔原代細胞研究工作多年的老前輩進行了請教問詢, 這才發(fā)覺發(fā)現(xiàn)兔組織進行消化時所需的酶濃度相較于小鼠而言會比其低百分之二十左右的數(shù)值, 然而消化所需要的時間卻要延長增長到原來的兩倍時長。老周開展了一次嘗試試驗, 細胞得率直接出現(xiàn)了翻倍翻了一番的情況, 存活率也穩(wěn)穩(wěn)地穩(wěn)定在百分之八十以上的水平。
他講了, 這件事情致使他領(lǐng)悟出了一個道理, 即源自初次獲取的細胞進行培養(yǎng), 不可以將他人的方案原封不動地照抄, 一定要依據(jù)自身手頭所擁有的材料進而去調(diào)校參數(shù)。
培養(yǎng)過程中，這些坑你得避開
培養(yǎng)基配方不能隨便抄
初次養(yǎng)兔肝細胞的老周, 使用的是實驗室一直在通用的培養(yǎng)基配方，然而細胞在第三天的時候就開始出現(xiàn)變圓的狀況, 然后相繼脫落。剛開初他認定是被污染了, 于是反反復(fù)復(fù)檢查了三天時間, 把所有有可能的情況都排除掉了。最終才對培養(yǎng)基方面的問題產(chǎn)生懷疑。
他耗費了兩個星期的時間, 嘗試了市面上五種各不相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 還搭配了三種血清, 最終發(fā)覺兔原代細胞對于特定品牌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及血清批次均存在偏好。一旦尋覓到恰當?shù)慕M合, 細胞便能夠生長得頗為良好, 倘若更換為另一個批次, 效果即刻會大打折扣。
老周當下所采取的做法是, 每當獲取到新一批次的血清, 或者是培養(yǎng)基之后, 首先會開展一次小試, 在確定沒問題了的情況下, 才會將其應(yīng)用到正式的實驗當中。
培養(yǎng)環(huán)境的細節(jié)決定成敗
老周跟我講了件事, 特別有意思。有一回他發(fā)現(xiàn), 同一批分離的兔原代細胞, 放在培養(yǎng)箱上層孔板里, 和放在下層孔板里, 存活率相差百分之二十。他排查許久, 最后發(fā)現(xiàn), 是培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度分布不均勻, 上層二氧化碳濃度低, 下層二氧化碳濃度高。
此后, 他購置了一臺二氧化碳檢測儀, 于培養(yǎng)箱之內(nèi)進行多點測量, 對架子位置予以調(diào)整, 如此這般才將這個問題予以解決。老周講道, 培養(yǎng)兔原代細胞之時, 諸多問題實際上并非技術(shù)方面的問題, 而是細節(jié)層面的問題。你自認為自身操作不存在問題, 然而環(huán)境之中任何一個參數(shù)出現(xiàn)波動, 細胞都會對你顯現(xiàn)出不同的狀況。
如何判斷細胞狀態(tài)好不好？
顯微鏡觀察的幾個指標
老周跟我講, 好多人看細胞時僅僅只看數(shù)量以及形態(tài), 實際上這遠遠是不足夠 的狀態(tài)。他具備自身獨特的那一套判斷標準。
檢視細胞邊緣是不是清晰, 健康的兔原代細胞邊緣銳利, 如同刀切的那般, 狀態(tài)欠佳的細胞, 邊緣會模糊, 仿若暈開了似的。
注視細胞質(zhì)以內(nèi)的顆粒, 老周講, 兔原代細胞相較于小鼠細胞更易于呈現(xiàn)出空泡以及顆粒增多的狀況, 一旦察覺到細胞質(zhì)當中存在眾多小泡泡, 大體能夠判定細胞處于應(yīng)激狀態(tài), 必須立刻對培養(yǎng)條件予以調(diào)整。
審視貼壁的速度, 通常來講, 兔子的原代細胞于接種之后的四至六個小時之際便理應(yīng)著手貼壁, 設(shè)若超出八小時依舊未能貼好, 這便表明細胞在分離的進程當中受到了損傷, 后續(xù)會極難維護良好的生長狀態(tài)。
功能性驗證不能省
老周還著重講了一點, 兔原代細胞不但要模樣長得好看, 而且還得具備相應(yīng)功能。他曾開展過一個對比實驗, 有一批細胞長相極為漂亮, 貼壁率在百分之九十五以上, 然而一旦進行功能性檢測, 就發(fā)現(xiàn)相關(guān)酶的活性僅僅是正常情況的百分之四十。之后他經(jīng)過分析, 推測或許是由于消化時間過長, 盡管細胞沒有死亡, 可是表面受體已然遭到破壞了。
他如今在每一個批次當中, 都會抽取一部分細胞去進行功能性驗證 , 待確認沒有問題以后方才用于正式實驗。盡管增添了一步操作 , 但是規(guī)避了后續(xù)實驗全部徒勞無功的風(fēng)險。
兔原代細胞的應(yīng)用，這些項目都在用
體外藥物篩選
參與那個項目的老周, 所涉及的項目是運用兔原代肝細胞來開展藥物代謝以及毒性評價工作。身處他們的公司有這樣的發(fā)現(xiàn), 那就是兔原代細胞在針對某些藥物的代謝途徑方面和人具有的相似度是高于小鼠的, 基于此所以專門致力于開發(fā)建立在兔原代細胞基礎(chǔ)之上的藥篩模型。
疾病機制研究
老周還提及, 當下諸多實驗室運用兔原代細胞去研究心血管疾病, 以及眼科疾病。兔子的眼睛結(jié)構(gòu)與人類相近, 在許多研究里兔原代視網(wǎng)膜細胞是首選模型。他講道, 要是能夠?qū)⑼迷毎B(yǎng)好, 實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量會提升一個等級。
老周踩過的最貴的坑
老周跟我講過一件事, 他始終覺得特別懊悔, 去年年末時分, 他做了一批兔原代細胞, 打算用于一個關(guān)鍵的項目, 那時他手頭有一個全新的培養(yǎng)方案, 還沒來得及去驗證, 然而他著急要用, 于是就直接采用了, 結(jié)果細胞養(yǎng)到第五天的時候, 全都死了, 整整兩個月的實驗數(shù)據(jù)全報廢了, 項目延期了三個月。
他講道, 自那以後，他為自己制訂了一項鐵律呢: 任何新的方案, 新的試劑, 新的操作, 都必須先于一小部分細胞之上進行驗證, 在確認沒有問題之后才能夠大規(guī)模地予以使用。寧愿進度慢一些, 也絕不能去冒險。
總結(jié)一下老周的經(jīng)驗
老周當下從事兔原代細胞工作, 已然構(gòu)建起一套標準流程, 取材時間限定在三十分鐘以內(nèi), 對消化條件予以優(yōu)化, 針對培養(yǎng)基以及培養(yǎng)環(huán)境的細節(jié)加以把控, 每一步驟均存有明確的注意要點, 他講, 原代細胞培養(yǎng)實際上并無諸多捷徑可行, 關(guān)鍵在于兩點, 其一乃尊重每一種細胞自身的特性, 其二是將每一個細節(jié)落實到位。
倘若你同樣是在開展兔原代細胞相關(guān)工作, 企望老周的過往經(jīng)歷能夠助力你減少不少走彎路的情況發(fā)生。對于養(yǎng)細胞這般事宜, 經(jīng)驗皆是依靠時間不斷累積而成的，然而只要方向是正確無誤的, 那就能夠節(jié)省諸多試錯所要付出的成本哦。
