超氧陰離子清除能力試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交鏈或者斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機(jī)體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。
測(cè)定原理
AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2－，NO2－與對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力與530nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體1.5mL×1支，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加6mL蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體7.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑五：液體7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品處理
組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。
粉劑藥物可配制成相同濃度，比如1mg/mL。
測(cè)定操作
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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試劑一（μL） |
10 |
10 |
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試劑二（μL） |
40 |
40 |
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H2O（μL） |
25 |
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充分混勻，25℃反應(yīng)1min |
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樣品（μL） |
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25 |
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試劑三（μL） |
50 |
50 |
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充分混勻，37℃反應(yīng)30min |
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試劑四（μL） |
50 |
50 |
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試劑五（μL） |
50 |
50 |
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充分混勻，37℃顯色20min，于微量石英比色皿/96孔板，在530nm處測(cè)定對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值，分別記為A對(duì)照管和A測(cè)定管。 |
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注意：對(duì)照管只需測(cè)定一次。
計(jì)算公式
超氧陰離子清除率 I%=
注意事項(xiàng)
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