葡萄糖含量試劑盒說(shuō)明書（測(cè)組織、細(xì)菌或細(xì)胞）
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的唯一能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。
測(cè)定原理：
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水
試劑的組成和配制：
試劑一：0.5μmol/mL葡萄糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體 10ml×1瓶，4℃保存；
試劑三：液體 10ml×1瓶，4℃保存；
葡萄糖提?。?/p>
1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），研磨成勻漿，95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。
2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），95℃水浴10分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心10min，取上清液備用。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零。
2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三1:1等體積混合，用多少配多少。
3、加樣表（在EP管或96孔板中加入下列試劑）：
|
試劑（μL） |
空白管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
測(cè)定管 |
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樣本 |
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20 |
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試劑一 |
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20 |
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蒸餾水 |
20 |
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混合試劑 |
180 |
180 |
180 |
混勻，置37℃（哺乳動(dòng)物）或25'C（其它物種）保溫15min后，于505nm波長(zhǎng)處讀取吸光度?？瞻坠堋?biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為A1、A2和A3?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
葡萄糖含量計(jì)算：
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
葡萄糖含量(μmol/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷
(A2-A1)÷Cpr。
2、按樣本鮮重計(jì)算
葡萄糖含量（μmol/g 鮮重）= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0.5×(A3-A1)÷
(A2-A1)÷W
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
葡萄糖含量（μmol/ 104 cell)= (C標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0.001×(A3-A1)÷
(A2-A1)
C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。注意：最低檢測(cè)限為50nmol/g鮮重或0.5nmol/mg prot
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