谷胱甘肽還原酶（GR）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲(chóng)中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。
測(cè)定原理：
GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時(shí)NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長(zhǎng)無(wú)吸收峰；通過(guò)測(cè)定340 nm吸光度下降速率來(lái)測(cè)定NADPH脫氫速率，從而計(jì)算GR活性。
自備儀器和用品：
低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水
試劑組成和配置：
試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。
試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。
粗酶液提?。?/p>
操作步驟：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動(dòng)物）中預(yù)熱30min。
3. 測(cè)定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，于340nm迅速測(cè)定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測(cè)1和A測(cè)2，△A測(cè)定管= A測(cè)1﹣A測(cè)2。
(注意：
3.當(dāng)所測(cè)△A測(cè)定管的值在零點(diǎn)附近徘徊時(shí)，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進(jìn)行測(cè)定；（2）樣本GR酶活性過(guò)高，吸光值變化區(qū)間過(guò)小無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)出，建議樣本稀釋2~5倍后再進(jìn)行測(cè)定)
計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 536×△A測(cè)定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測(cè)定管÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
= 536×△A測(cè)定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 1072×△A測(cè)定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1072×△A測(cè)定管÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1072×△A測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測(cè)定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
=1072×△A測(cè)定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。
注意事項(xiàng)：
（1）樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；
（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完。
（3）測(cè)定前須先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。
（4）細(xì)胞中GR活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GR的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。
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