| 貨號 | 純度 | 規(guī)格 | 目錄價(jià) | 會(huì)員價(jià) | 庫存 | 數(shù)量 | 購買 |
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| AP62269-50T | 50T | 50T | ￥22450.00 | 登錄查看 |
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【預(yù)期用途】
本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測的試劑盒。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒可在一次反應(yīng)中快速檢測五種病原體：肺炎鏈球菌 1 型、3 型、4 型、5 型、6 型。肺炎鏈球菌的血清型分類是基于其莢膜多糖抗原結(jié)構(gòu)的差異，目前已發(fā)現(xiàn)的血清型超過 100 種。不同血清型在致病力、流行特點(diǎn)、好發(fā)人群和引起的疾病類型上存在顯著差異。1 型和 5 型是經(jīng)典的致病菌，在成人和兒童中均占有重要地位，且與膿胸等并發(fā)癥相關(guān)。3 型因其獨(dú)特的生物學(xué)特性而成為毒力最強(qiáng)的血清型，需要警惕其導(dǎo)致的高病死率。型屬于常見致病血清型，廣泛存在于各類感染中。6 型（特別是 6B）則是兒童感染的“主力軍”，且耐藥問題較為突出。根據(jù)探針法熒光定量 PCR 原理開發(fā)。
【試劑組成】
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名 稱 |
規(guī) 格 |
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2 × Probe qPCR Mix |
700uL×1管 |
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ddH2O |
1 mL×1 管 |
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五重 qPCR 引物混合液 |
2 00uL×1 管 |
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五重 qPCR 探針混合液 |
110 uL×1 管 |
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五重 qPCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL) |
50μL |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【運(yùn)輸及保存】
避光-20±5℃保存，有效期12個(gè)月。開封后避光-20±5℃保存，對有效期沒有影響；
冰袋低溫運(yùn)輸4天、反復(fù)凍融5次對效期沒有影響。
【自備試劑】
樣品 DNA。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【使用方法】
一、核酸提取(樣本制備區(qū))
用自選方法提取純化樣品 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，避免污染樣
品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL ddH2O，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
準(zhǔn)備足量的 qPCR 管（樣品管、陰性對照管、陽性對照管），向各 qPCR 管中分別加入下列成分。：
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成分 |
N個(gè) 待檢樣品管 |
qPCR 陰性對照管 |
qPCR 陽性對照管 |
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2 × Probe qPCR Mix |
各 12.5 μL |
12.5 μL |
12.5 μL |
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五重 qPCR 引物混合液 |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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五重 qPCR 探針混合液 |
各2μL |
2μL |
2μL |
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ddH2O |
各 4.5 μL |
4.5 μL |
4.5 μL |
轉(zhuǎn)移至模版添加區(qū)
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 2ul 模板，順序?yàn)殛幮詫φ眨╠dH2O）、待測樣品模板、五重qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：
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過程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
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qPCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） |
95℃ |
15sec |
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60℃ |
20sec |
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信號通道 |
同時(shí)選擇 FAM/HEX/ROX/Cy5 通道采集熒光信號 |
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Target |
熒光基團(tuán) |
猝滅基團(tuán) |
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肺炎鏈球菌 1 型 |
FAM |
MGB |
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肺炎鏈球菌 3 型 |
HEX |
None |
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肺炎鏈球菌 4 型 |
ROX |
MGB |
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肺炎鏈球菌5 型 |
Cy5 |
MGB |
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肺炎鏈球菌6 型 |
Cy5.5 |
BHQ2 |
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，推算出其濃度。
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照結(jié)果：Ct 值<30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。
陰性對照結(jié)果：Ct 值>38 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<35，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該菌種，結(jié)果為陽性；Ct 值>38 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該菌種，結(jié)果為陰性；Ct 值在 35-38 范圍，應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)檢，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在 35~38 范圍，有明顯指數(shù)增長，則判定為陽性，否則為陰性。
【注意事項(xiàng)】
1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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人皰疹病毒5型(human herpesvirus5，HHV-5) 原人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
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資料/datasheet
